آنالیز همزمان RNA، پروتئین و بیومارکرهای لیپیدی در نمونه های بافتی هتروژن
پیش زمینه: با تلاش هایی در جهت گسترش بیومارکرها و افزایش هزینه ی تهیه ی دارو بیشینه سازی مقدار نمونه-های بالینی با وزن محدود، ضروری است. محدودیت اصلی روش های دردسترس ناتوانی در زمینه ی تحلیل و جداسازی از یک نمونه است که مولکول ها به روش های استخراج ناسازگاز نیاز دارند. بنابراین روش نیمه خودکار جدیدی برای فراوری بافت و تقطیع بافتی و تقسیم (TMAD) را گسترش دادیم.
روش ها: ما از یک ابزار SilverHawk برای جمع آوری پلاک های آترواسکلروزی از بیماران نیازمند به آتروکتومی پیرامونی استفاده کردیم. حفاظت بافتی با استفاده از فریز کردن فلش با ایمرسیون در RNAlater و خرد کردن بافتی با استفاده از هاون با TMAD مورد مقایسه قرار گرفت. موارد مقایسه بازده پروتئین ها، RNA، لیپید و کیفیت آن ها بودند. تکرارپذیری محصول آنالیت از بخش هایی از نمونه ی بافتی مشابه که بوسیله ی TMAD فراوری شده بود نیز مورد سنجش قرار گرفت.
نتایج: کمیت و کیفیت بیومارکرهای مستخرج از بافت که با TMAD آماده شد حداقل به اندازه ی آنجه از بافت ذخیره شده و آماده شده با روش های قدیمی تهیه می شد، نبود. TMAD تحلیل موازی بیان ژن (PCR کمی معکوس، میکرواری)، ترکیب پروتئنی (ELISA)و محتوای لیپیدی (سنجش بیوشیمیایی) از 20 میلی گرم بافت را ممکن شاخته است. ارتباط متوسط در ترکیب پروتئنی r=0.97 () بین بخش های نمونه های گرفته شده از TMAD بود. ما همچنین تعیین کردیم که استفاده از TMAD در مطالعات بالینی در مقیاس بالا نیز شدنی است.
نتیجه گیری: روش TMAD که در اینجا توضیح داده شده است، نمونه برداری نیمه خودکار و پربازده برای مقادیر کوچک نمونه های بافتی هتروژن توسط تکنیک های تحلیلی چندگانه با کیفیت بیومولکول های بازیابی شده را امکان پذیر ساخته است.
پیاده سازی روش های کارامد برای فراوری و تحلیل نمونه های زیستی جزء مهمی در اجرای روند درمانی است. محدودیت اصلی روش های دردسترس عدم توانایی در جداسازی و تحلیل مولکول های نیازمند به روش های استخراج ناسازگار می باشد.
چون بیشتر نمونه های بافتی از نظر ترکیبی هتروژن هستند، برای مثال پلاک اترواسکلروزیس (شکل 1) و بافت توموری، تحلیل و استخراج بیومارکرها از قطعات مختلف می تواند منجر به نتایج گمراه کننده شود. بنابراین گسترش یک روش عمومی برای تقسیم یک نمونه ی بالینی به بخش های مشابه از نظر ترکیبی ضرورتا مهم است.
بحث
ما روش نیمه خودکاری را برای تقطیع بافتی به بخش های برابر از نظر ترکیبی طراحی، مهندسی و اعتبارسنجی کردیم. این تکنیک تحلیل به صرفه ای را از بیومارکرهای نیازمند به فرایندهای ناسازگار استخراج بافتی در نمونه-های واحد ممکن می سازد. TMAD فرایندهای برشی و شکست را استاندارد می کند و امکان افزایش بازده و میزان بالایی از بازیابی نمونه ها را از نمونه های کوچک بافتی فراهم می کند (98%). همه ی موادی که در تماس با بافت قرار دارند یک بار مصرف هستند که باعث کاهش خطر آلودگی های ناخواسته می شود. TMAD با آنالیز کمی mRNA ، پروتئین و محتوای لیپیدی سازگار بوده و امکان تعیین خصوصیات جزئی ترکیبات مولکولی بافت را بدون نیاز به جمع آوری نمونه های جداگانه برای هر آنالیز فراهم می کند.
BACKGROUND: With expanding biomarker discovery efforts and increasing costs of drug development, it is critical to maximize the value of mass-limited clinical samples. The main limitation of available methods is the inability to isolate and analyze,from a single sample, molecules requiring incompatible extraction methods. Thus, we developed a novel semiautomated method for tissue processing and tissue milling and division (TMAD).
METHODS: We used a SilverHawk atherectomy catheter to collect atherosclerotic plaquesfrom patients requiring peripheral atherectomy. Tissue preservation by flash freezing was compared with immersion in RNAlater, and tissue grinding by traditional mortar and pestle was compared with TMAD. Comparators were protein, RNA, and lipid yield and quality. Reproducibility of analyte yield from aliquots of the same tissue sample processed by TMAD was also measured.
RESULTS: The quantity and quality of biomarkers extracted from tissue prepared by TMAD was at least as good as that extracted from tissue stored and prepared by traditional means. TMAD enabled parallel analysis of gene expression (quantitative reverse-transcription PCR, microarray), protein composition (ELISA), and lipid content (biochemical assay) from as little as 20 mg of tissue. The mean correlation was r 0.97 in molecular composition (RNA, protein, or lipid) between aliquots of individual samples generated by TMAD. We also demonstrated that it is feasible to use TMAD in a large-scale clinical study setting.
CONCLUSIONS: The TMAD methodology described here enables semiautomated, high-throughput sampling of small amounts of heterogeneous tissue specimens by multiple analytical techniques with generally improved quality of recovered biomolecules.
The implementation of efficient methods for processing and analysis of biological samples is an important component of the execution of clinical trials. The main limitation of available methods is the inability to isolate and analyze, from a single specimen, molecules requiring incompatible extraction methods.
Because most tissue samples are compositionally heterogeneous, e.g., atherosclerotic plaque (1 ) (Fig. 1) and tumor tissue (2 ), extraction and analysis of biomarkers from different fragments can lead to misleading results. Therefore, the development of a universal method for dividing a clinical specimen into compositionally identical aliquots is critically important.
Discussion
We designed, engineered, and validated a semiautomated technique (TMAD) for splitting tissue into compositionally identical aliquots. This technique enabled cost-effective analysis of biomarkers requiring noncompatible tissue extraction protocols in single samples. TMAD standardizes the milling and splitting processes and allows increased throughput and a high rate of sample recovery from small tissue specimens (98%). All materials that contact tissue are disposable, eliminating the risk of cross contamination. TMAD is compatible with quantitative analysis of mRNA, protein, and lipid content, enabling detailed characterization of molecular composition of tissue without the need to collect separate specimens for each analysis.
(جهت بزرگ نمایی روی عکس کلیک نمایید)
تحلیل ایمونوهیستوشیمیایی و بافت شناسی
روش های دست ورزی بافتی
استخراج RNA و تحلیل
استخراج پروتئین و تحلیل
جداسازی لیپید و تحلیل آن
مقایسه محتوای لیپیدی در اندام پایینی چپ و راست
انالیزهای آماری
نتایج
بهینه سازی جمع آوری بافت و دستورالعمل حفاظتی
دزهای آسیاب دستی با کیفیت RNA مطابقت ندارد
بخش های نمونه که با استفاده از GEMS به دست آمده از نظر ترکیبی برابر هستند
گسترش روش شبیه سازی تقطیع بافتی
مقایسه ویژگی های عملکردی بین GEMS و TMAD
کاربرد روش تقطیع بافتی در مقیاس بالا
بحث
Materials and Methods
TISSUE COLLECTION METHODS
HISTOLOGICAL AND IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS
TISSUE-PROCESSING METHODS
RNA EXTRACTION AND ANALYSIS
PROTEIN EXTRACTION AND ANALYSIS
LIPID EXTRACTION AND ANALYSIS
COMPARISON OF LIPID CONTENT IN LEFT AND RIGHT LOWER EXTREMITIES
STATISTICAL ANALYSES
Results
OPTIMIZATION OF TISSUE COLLECTION AND PRESERVATION PROTOCOL
MANUAL GRINDING DOES NOT COMPROMISE RNA QUALITY
SAMPLE ALIQUOTS GENERATED BY GEMS ARE COMPOSITIONALLY EQUIVALENT
DEVELOPMENT OF A SEMIAUTOMATED METHOD FOR TISSUE SPLITTING
COMPARISON OF PERFORMANCE CHARACTERISTICS BETWEEN GEMS AND TMAD
LARGE-SCALE APPLICATION OF THE TISSUE-SPLITTING METHOD
Discussion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه