ارزیابی حساس آپوپتوزیس سلول بر اساس تشخیص فعالیت caspase-3
خلاصه
این مقاله یک روش جدید برای ارزیابی های ساده ی آپوپتوزیس سلول با استفاده از تکنیک الکتروشیمیایی را گزارش می کند. در این مطالعه، فعالیت caspase-3 که با ولت متری پالس افتراقی (DPV ) به عنوان جایگزین روش اسپکترومتری مرسوم تشخیص داده شد ، به عنوان اندیکاتور آپوپتوزیس سلول به کار گرفته شد ، در این حال از پپتید استیله شده ی Ac-GGHDEVDHGGGC به عنوان سوبسترای بلوکه شده استفاده شد. در حضور casepase-3 ، پپتید بلوکه شده می تواند گروه های آمین آژاد کند که می تواند به صورت کووالانت با اکسید گرافن کونژوگه شود. بنابراین، مولکولهای متیلن بلوی فعال الکتریکی میتوانند از طریق استکینک π–π و میانکنش های الکترواستاتیک بیشتر به سطح الکترود متصل شوند. با استفاده از این روش جدید پیشنهاد شده ، می توان به تشخیص بسیار حساسی از caspase-3 با محدودیت تشخیصی پایین 0.06 pg/mL, دست پیدا کرد ، و یک روش تشخیص حساس برای آپوپتوزیس سلول ایجاد کرد. علاوه بر این ما با موفقیت از این روش جدید برای تشخیص آپوپتوزیس سلولی در سلول کارسینومای ریوی انسانی A549 بعد از القاء آپوپتوزیس استفاده کردیم .
مقدمه
آپوپتوزیس ، یا به اصطلاح مرگ برنامه ریزی شده ، یک فرایند زیستی بسیار تنظیم شده است که با سرنوشت سلول مرتبط است. این پدیده باعث از بین بردن سلولهای نامطلوب از بافت ها در طول متابولیسم فیزیولوژیکی طبیعی می شود و به توسعه و عملکرد سیستم ایمنی و بازآرایی مجدد بافت ها کمک می کند. غیر طبیعی شدن فرایند تنطیم آپوپتوزیس به وسیله ی پاتوژنی و پاسخ شیمی درمانی برای انواعی از بیماری ها مانند سرطان ، ناراحتی های روانشناختی ، تصلب شریان، انفارکتوس میوکارد و بیماری های خود ایمن به کار گرفته می شود. بنابراین، تشخیص آپوپتوزیس نه تنها برای علوم زیستی بلکه برای ارزیابی پیشرفت بیماری، درمان پزشکی، توسعه-ی دارویی و مدیریت امنیت غذایی کاملا ضروری است. بنابراین، بسیاری از پروتیین هایی که برای آپوپتوزیس ضروری هستند شناسایی شده اند. از میان این پروتیین ها، مشخص شده است که خانواده ی کاسپاز (پروتییناز های اختصاصی آسپارتات وابسته به سیستئین ) یک نقش مهم در آپوپتوزیس سلولی بازی می کنند.
4. نتیجه گیری
به طور خلاصه، ما در این پژوهش یک روش الکتروشیمیایی را برای تشخیص آپوپتوزیس سلولی بر اساس استراتژی SIGNAL-ON القاء شده با کاسپاز-3 تقویت شده با GO را پیشنهاد کرده ایم. از آنجایی که پروتیین هدف یعنی کاسپاز-3 در محدوده ی 0.1 تا 100 پیکوگرم/ میلی لیتر قابل تشخیص است محدودیت تشخیص با روش ما 0.06 pg/ml است. این روش 103 تا 105 برابر حساس تر از سایر موارد گزارش شده است. علاوه بر این، سیستم ما پاسخ خوبی به نمونه های واقعی نشان می دهد نشان دهنده ی پتانسیل کاربردی بودن آن است. علاوه بر این، این روش دارای مزیت های دیگری نیز است. از یکطرف، این روش از استراتژی signal-on القاء شده با برش اختصاصی استفاده می کند که نسبت به پروتیین های غیر هدف فوقالعاده مقاوم است و بنابراین منجر به اختصاصیت بالایی می شود. از طرف دیگر ، به دلیل اینکه هر پروتیین هدف پپتیداز با گروه های آمینوی آزاد در توالی اتصالی می تواند ترجمه شود ، این روش می تواند برای ارزیابی های اهداف زیادی به کار گرفته شود. مطمئنا، اکنون مسائل وجود دارند که امکان به کارگیری روش پیشنهادی را محدود می کنند. برای مثال، اگر پپتید سوبسترا دارای بار منفی زیاد و یا بارمثبت زیاد باشد این سیستم ممکن است سیگنال های مثبت کاذب و خطاهای گسترده بروز دهد که حساسیت و اختصاصیت تشخیص را کاهش می دهد. در مقابل ، با دقیق تر کردن و بهینه سازی سوبسترا و شرایط ، این روش می تواند برای ارزیابی بسیاری از گونه های پروتیینی مورد استفاده قرار بگیرد.
Abstract
This paper reports a novel approach for the simple assays of cell apoptosis using electrochemical technique. In this study, caspase-3 activity, which was detected with differential plus voltammetry (DPV) as an alternative to conventional spectrometry approach, was employed as an indicator of cell apoptosis and, while an acetylated peptide Ac-GGHDEVDHGGGC was used as the blocked substrate. In the presence of casepase-3, the hydrolysis of blocked peptide might release active amine groups, which could covalently conjugate with graphene oxide. Therefore, electroactive methylene blue molecules could be further attached to the electrode surface through π–π stacking and electrostatic interactions. Using this proposed new method, a very sensitive detection of caspase-3 could be achieved with a low detection limit of 0.06 pg/mL, and a new method for sensitive detection of cell apoptosis was developed. Moreover, we have successfully used this new method to detect cell apoptosis with human pulmonary carcinoma A549 cell after apoptosis inducing.
1. Introduction
Apoptosis, the so-called programmed cell death, is a highly regulated biological process that is associated with the cell fate. It conducts to eliminate the unwanted cells from tissues during normal physiological metabolism, help develop and function the immune system and remodel tissues. Abnormality of apoptosis regulation process is involved with pathogeny and chemotherapy response for a variety of diseases such as cancer, neurological disorders, atherosclerosis, myocardial infarction, and autoimmune diseases (Favaloro et al., 2012; Haunstetter and Izumo, 1998). Therefore, detection of apoptosis is critically essential not only for biological science but also for the evaluation of disease progression, medical treatment, pharmaceutical development, and food safety management (Brunelle and Zhang, 2010; Carson and Ribeiro, 1993; Pan et al., 2008), etc. So, many of the proteins that are critical to apoptosis have been identified. Among them, the caspase family (cysteine-dependent, aspartate-specific proteinases) is revealed to play an important role in cellular apoptosis.
4. Conclusions
In summary, we have proposed an electrochemical approach in this work for the detection of cell apoptosis based the caspase-3 triggered signal-on strategy with GO-assisted amplification. As the target protein, caspase-3 can be detected in a range of 0.1– 100 pg/mL. A low detection limit of 0.06 pg/mL was obtained with our approach. It is 103 –105 times more sensitive compared to other reports. Besides, our system also shows well response to the real samples, indicating its potential application. Furthermore, this approach has also demonstrated some other advantages. On one hand, the approach makes use of the specific cleavage triggered signal-on strategy and is highly resistant to non-target proteins, thus resulting in excellent specificity. On the other hand, because any target protein of peptidase with no free amino group in the binding sequence can be translated in principle to the study of the very commonly employed peptides, this approach may be extended to the assays of numerous targets. Certainly, there still are some issues that may limit the extended application of the proposed approach. For instance, this system may displays a false positive signal and broad noise background if the substrate peptide is highly charged positively or negatively, which will take the edge off the sensitivity and specificity of the detection. Nevertheless, with elaborate and optimized substrate and condition, this approach will be extended to the assays of more species of proteins in the future.
(جهت بزرگ نمایی روی عکس کلیک نمایید)
خلاصه
1. مقدمه
2. مواد و روش ها
2.1 مواد
2.2 آماده سازی و اصلاح الکترود
2.3 کشت سلول و القاء آپوپتوزیس
2.4 هضم کاسپاز-3 و تیمار بقایای هضم سلول
2.5 کونژگاسیون اکسید گرافن (GO ) و جذب متیلن بلو (MB)
2.6 اندازه گیری های الکتروشیمیایی
2.7 شناسایی با میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)
3. نتایج و بحث
3.1 شناسایی تغییرات پپتید و واکنش آنزیم بر روی الکترود طلا
3.2 تقویت سیگنال الکتروشیمیایی با کمک اکسید گرافن
3.3 بهینه سازی شرایط sensing
3.4 حساسیت و اختصاصیت حسگر
3.5 تشخیص کاسپاز-3 در سلول کارسینومای ریوی انسانی A549
4. نتیجه گیری
Abstract
1. Introduction
2. Material and methods
2.1. Materials
2.2. Electrode preparation and modification
2.3. Cell culture and inducing apoptosis
2.4. Caspase-3 digestion and cell lysate treatment
2.5. GO conjugation and MB absorption
2.6. Electrochemical measurements
2.7. Atomic force microscopy (AFM) characterization
3. Results and discussions
3.1. Characterization of peptide modification and enzyme reaction on the gold electrode
3.2. Graphene oxide-assisted electrochemical signal amplification
3.3. Optimization of sensing conditions
3.4. Sensor’s sensitivity and selectivity
3.5. Detection of caspase-3 in Human pulmonary carcinoma A549 cell
4. Conclusions
- اصل مقاله انگلیسی با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه