جداسازی پپتید نگهدارنده مواد غذایی از خربزه تلخ (Momordica charantia L.) و توصیف ویژگی های آن
چکیده
به منظور نگهداری مواد غذایی و فاسد نشدن آنها توسط میکروارگانیسم‌ها، از عوامل ضدمیکروبی (AMAs) که به عنوان مواد نگهدارنده نیز شناخته می‌شوند استفاده می‌گردد. این مواد نگهدارنده، از گیاهان بدست می‌آیند یا بصورت شیمیایی سنتز می‌گردند و اکثراً جزء عوامل ضدمیکروبی غیرپروتئینی هستند. در این بین، به عوامل ضدمیکروبی پروتئینی به عنوان ماده نگهدارنده مواد غذایی، توجه کمتری شده است. بنابراین، بررسی عوامل پروتئینی که می‌توانند فعالیت ضدمیکروبی داشته باشند و جایگزین مواد نگهدارنده مصنوعی فعلی شوند ضروری می‌باشد. لذا، این پژوهش اساساً به منظور جداسازی پپتیدهای دارای فعالیت ضدباکتریایی از قسمت‌هایی مختلف خربزه تلخ (Momordica charantia L.) و توصیف ویژگی‌های آنان انجام شده است. عصاره خام بذرها، مغز ساقه و پوست گیاه با نمک بافر فسفات (PBS) آماده شدند و فعالیت ضدباکتریایی آنها در محیط کشت لوریا برتانی براث آگار (LB) بر روی سویه‌هایی از قبیل اشرشیا کلای (Escherichia coli)، استافیلوکوکوس اروئوس (Staphylococcus aureus)، سالمونلا تیفی (Salmonella typhi)، و سودوموناس آئروژینوزا (Pseudomonas aeruginosa) بررسی شد. از آنجاییکه فعالیت ضدمیکروبی فقط در عصاره بذرها مشاهده شد بنابراین، پپتید/پپتیدهای موجود در عصاره بذر با محلول سولفات آمونیوم 75٪ رسوب داده شدند؛ و برای خالص-سازی آنها از روش کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (GFC) و ستون Sephadex G-100 استفاده گردید. فعالیت ضدمیکروبی پپتیدهای موجود در رسوبات حل شده در سولفات آمونیوم و جزءهای پیک در کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی (1-4) نیز بررسی شدند. علاوه بر این، با استفاده از الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) همگنی و جرم مولکولی پپتیدهای موجود در جزءهای ادغام شده کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی، عصاره خام سلولی، و رسوبات حل شده در سولفات آمونیوم، تعیین گردید. در پیک 3 کروماتوگرافی، یک پپتید با جرم مولکولی 10 کیلودالتون و دارای فعالیت ضدمیکروبی به دست آمد. این پپتید خالص در محدوده دمایی50-4 درجه سانتیگراد پایدار بود؛ محدوده فعالیت آن بین pH5-7 قرار داشت؛ و توسط تریپسین و پروتئیناز K، غیرفعال می‌شد. براساس مقادیر حداقل غلظت مهاری (MIC) این پپتید خالص، مشخص شد که استافیلوکوکوس اورئوس حساس‌ترین سویه نسبت به این پپتید است. مشخص شد که در P <0.001 و غلظت 40 میکروگرم از این پپتید، تعداد کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس موجود در گوشت چرخ کرده به میزان معناداری از0/8 تا 77/3 log CFU کاهش یافتند. نتایج پژوهش ما نشان می‌دهد که پپتید ضدباکتریایی بدست آمده از بذرهای گیاه خربزه تلخ می‌تواند به عنوان یک نگهدارنده طبیعی و بیولوژیکی برای گوشت چرخ کرده، مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، تأثیر این پپتید بر میکروارگانیسم‌های دیگر، خصوصیات آن و سمی بودن یا نبودن آن، نیازمند انجام مطالعات بیشتر می‌باشد.
4. نتیجه گیری
براساس نتایج این تحقیق، نتیجه گیری می‌شود که بذرهای گیاهM. charantia L.، حاوی پپتیدی با وزن مولکولی کم (10 کیلودالتون) می‌باشند. از این پپتید می‌توان به عنوان ماده نگهدارنده زیستی جایگزین، برای کنترل رشد باکتریها بر روی گوشت چرخ کرده تازه، استفاده کرد. با این حال، برای اطمینان از اثربخشی و کارایی این پپتید به مطالعه و پژوهش بیشتری نیاز است.
Abstract
Antimicrobial agents (AMAs) also known as preservatives are being used to keep food safe and unspoiled from microorganism. These preservatives, derived from plant sources or synthesized chemically are mostly non-proteinaceous AMAs. Less attention has been given to proteinaceous AMAs which may be used as preservative in food. Thus, there is a need to explore proteinaceous AMAs having antimicrobial activity with potentials to be used as an alternative to the presently used preservatives which are mostly synthetic. Therefore, the present study was carried out systematically to isolate and characterize peptides having antibacterial activity from different parts of bitter melon (Momordica charantia L.). Crude aqueous extracts of seeds, pulp and skin were prepared in phosphate buffer saline (PBS) and antibacterial activity was checked on Luria Bertani (LB) broth agar plates against a number of bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi and Pseudomonas aeruginosa. Since antimicrobial activity was observed only in seeds therefore, seed extract was used for peptide(s) precipitation with 75% ammonium sulfate solution and purification by gel filtration chromatography (GFC) using Sephadex G-100. Antimicrobial activity was also checked in dissolved ammonium sulfate precipitate and GFC peak fractions (1–4). Further, homogeneity and molecular mass of GFC pooled fractions along with crude extract and dissolved ammonium sulfate precipitate were determined by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). One peptide with molecular mass ∼10 kDa with antimicrobial activity was obtained from peak 3. The purified peptide was stable at 4–50 °C, active between 5–7 pH and inactivated by trypsin and proteinase K. Based on minimum inhibition concentration (MIC) values of purified peptide S. aureus was found to be the most sensitive strain. The use of this strain with minced meat showed significant viable count decreased i.e. from 8.0 to 3.77 log CFU with P < 0.001 at concentration of 40 μg peptide. The results of our study suggest that antibacterial peptide obtained from seeds of M. charantia L. may be used as an alternative natural biopreservative source for minced meat products. However, further studies need to be carried out to check the effect of this peptide on more microorganisms, characterization and its toxicological analysis.
4. Conclusion
Based on the results of this study, it is concluded that seeds of M. charantia L. contains a low molecular mass peptide having 10 kDa. This peptide may be used as an alternative bio-preservative agent to control the growth of bacteria in fresh minced meat. However, further study is required to enhance the effectiveness of this peptide.
(جهت بزرگ نمایی روی عکس کلیک نمایید)
چکیده
1. مقدمه
2. مواد و روش‌ها
2.1. مجموعه گیاهان و میکروارگانیسم‌ها
2.2. استخراج پروتئین و خالص سازی جزئی
2.3. کروماتوگرافی فیلتراسیون ژلی و الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات -پلی آکریل آمید (SDS-PAGE)
2.4. سنجش فعالیت ضدمیکروبی
2.4.1. کشت ثانویه (زیرکشت/ کشت فرعی) سویه‌های باکتری
2.4.2. روش انتشار دیسک
2.4.3. حداقل غلظت بازدارنده در محیط‌های کشت
2.4.4. آنالیز آماری
2.5. اثر درجه حرارت‌های مختلف، pHهای متفاوت و آنزیم‌های پروتئولیتیک متنوع
2.6. اثر پپتید خالص بر روی گوشت چرخ کرده تلقیح شده با استافیلوکوکوس اورئوس
3. نتایج و بحث
3.1. فعالیت ضدمیکروبی
3.2. پروفایل کروماتوگرافی رسوب دیالیزی حل شده در سولفات آمونیوم که از بذرها بدست آمده اند
3.3. SDS-PAGE
3.4. اثر درجه حرارت‌های مختلف، pHهای متفاوت و آنزیم‌های متنوع بر فعالیت ضدمیکروبی پپتید خالص
3.5. اثر پپتید خالص بر تکثیر ظاهری باکتریها
3.6. تأثیر پپتید خالص بر تشکیل کلنی‌های زیست پذیر (قابل دوام/زنده ماندنی) استافیلوکوکوس اورئوس
4. نتیجه گیری
منابع
Abstract
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1. Collection of plant and microorganisms
2.2. Protein extraction and partial purification
2.3. Gel filtration chromatography and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE)
2.4. Antimicrobial assay
2.4.1. Sub-culturing of bacterial strains
2.4.2. Disc diffusion method
2.4.3. Minimum inhibitory concentration in culture media
2.4.4. Statistical analysis
2.5. Effect of various temperatures, pH and proteolytic enzymes
2.6. Effect of purified peptide on minced meat inoculated with S. aureus
3. Results and discussion
3.1. Antimicrobial activity
3.2. Chromatographic profile of dissolved and dialyzed ammonium sulfate precipitates of seeds
3.3. SDS–PAGE
3.4. Effect of various temperatures, pH and enzymes on antimicrobial activity of purified peptide
3.5. Effect of purified peptide on apparent proliferation of bacteria
3.6. Effect of purified peptide on viable count formation of S. aureus
4. Conclusion
References
- اصل مقاله انگلیسی با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه