دانلود مقاله اثرات ایمونوژن غذایی روی پاسخ ایمنی ذاتی، بیان ژن های مربوط به ایمنی و مقاومت به بیماری در ماهی قزل آلای رنگین کمانی

چکیده
     این مطالعه، اثرات ایمنوژن پری بیوتیک روی لیزوزوم، TNFα و  بیان ژن HSP70  فوق کلیه، پارامترهای ایمنی ذاتی هومورال و مقاومت به Aeromonas hydrophila در ماهی قزل آلای رنگین کمانی را بررسی می‌کند. 120 ماهی قزل آلای رنگین کمانی (81.65+_1.49g) در شش تانک فایبرگلاس در دو گروه تغذیه‌ای بررسی شده‌اند که یکی از آن‌ها گروه شاهد و دیگری گروه آزمایش ‌بوده‌است که با  2g/kg از ایمنوژن به مدت 45 روز تغذیه ‌شده‌است. نتایج نشان دادند که استفاده از ایمنوژن به طور قابل توجهی (p<0.05) باعث تنظیم بیشتر لیزوزیم و بیان ژن TNFα ‌می‌شود. بیان ژن HSP70 به طور قابل ملاحظه‌ای (p<0.05) در ماهی‌هایی که با ایمونوژن تغذیه ‌شده‌اند، در پایان آزمون پایین‌تر ‌بوده‌است. پارامترهای ایمنی ذاتی خونی (فعالیت لیزوزیم، ACH50 و اسیدیته باکتریایی) به طور قابل ملاحظه‌ای (p<0.05) در 15 یا 45 روز بعد از تغذیه با رژیم غذایی حاوی ایمونوژن افزایش یافته‌است. اگرچه، افزایش قابل توجه (p<0.05) در تیتر آنتی بادی آگلوتیناسیون فقط 45 روز بعد از تغذیه با ایمونوژن افزایش می‌یابد. ماهی‌های قزل آلای رنگین کمانی تغذیه شده با 2g/kg ایمنوژن، مقاومت بسیار بالاتری نسبت به  A.hydrophila (میزان زنده ماندن 64.44%) نسبت به گروه کنترل (24.44%) نشان داده‌اند. این نتایج تایید ‌می‌کند که ایمونوژن می‌تواند بیان ژن‌های مربوط به ایمنی را بیشتر تنظیم کند، پاسخ ایمنی را تحریک کند که در نهایت مقاومت به بیماری را در ماهی‌های قزل آلای رنگین کمانی افزایش می‌دهد. 

1.    مقدمه
     رهایی مواد ضد عفونی کننده و داروها در آب‌های حوضچه‌های پرورش ماهی، می‌تواند روی تمامیت میکروبیوتای دستگاه گوارشی، کاهش در عملکرد رشد و مهار پاسخ‌های ایمنی اثر بگذارد. هم چنین، مصرف آنتی بیوتیک‌ها ممکن است منجر به آلودگی مواد غذایی و محیط زیست و توسعه پاتوژن‌های مقاوم به آنتی بیوتیک شود. همراه با رشد بی وقفه آبزی پروری در طی سال‌های اخیر، توجهات ویژه ای به کاربرد دیدگاه‌های اکولوژیکی و دوستدار محیط زیست جلب ‌شده‌است، مثل محرک‌های ایمنی، پروبیوتیک‌ها و پری بیوتیک‌ها به عنوان جایگزینی برای آنتی بیوتیک درمانی. 
     پری بیوتیک‌ها، اجزای غذایی غیر قابل هضمی هستند که می‌توانند به صورت موثری روی میزبان تاثیر بگذارند و این کار را از طریق تحریک رشد یا فعالیت یک یا تعداد محدودی از باکتری‌ها در روده انجام می‌دهند، و بنابراین سلامت میزبان را بهبود می‌بخشند. اثرات مثبت پری بیوتیک‌ها روی پاسخ ایمنی و مقاومت به ماهی و حلزون صدف دار به خوبی مطالعه ‌شده‌است و مطالعات قبلی نشان داده‌است که پری بیوتیک‌ها می‌توانند هم روی مکانیسم‌های ایمنی ذاتی تاثیر بگذارند و هم روی سلول‌های درگیر در پاسخ ایمنی اختصاصی مشارکت کنند. 
     ایمنوژن یک پری بیوتیک تجاری است که به طور عمده حاوی بتا گلوکان و مانوالیگوساکارید (MOS) است که از دیواره سلول مخمر Saccharomyces cervisiea مشتق ‌شده‌است. MOS و بتاگلوکان نشان داده‌اند که اثرات مفیدی روی مکانیسم ایمنی اختصاصی و غیر اختصاصی جانوران تک معده‌ای دارند. ابراهیمی  و همکارانش، بهبود عملکرد رشد و پاسخ ایمنی را در ماهی‌های کپور معمولی گزارش کردند، بعد از اینکه از ایمونوژن در رژیم غذایی استفاده شد. علیرغم پیشرفت‌های اخیر در حوزه مصرف پری بیوتیک‌ها در آبزی پروری، اطلاعات محدودی راجع به اثرات مصرف ایمنوژن‌ها و هم چنین دیدگاه‌های ژنتیکی مربوط به اثرات پری بیوتیک‌ها روی سیستم ایمنی ماهی وجود دارد. بنابراین، هدف مطالعه اخیر، تعیین اثرات ایمنوژن خوراکی روی بعضی از پارامترهای خونی، پاسخ ایمنی هومورال، بیان ژن‌های مربوط به ایمنی (لیزوزیم، lyz2)، فاکتور نکروز توموری α، پروتئین شوک حرارتی 70 (HSP70) و مقاومت به Aeromonas hydrophila است. 

4.    بحث
     به خوبی مشخص ‌شده‌است که استفاده از پری بیوتیک‌های خوراکی، پاسخ ایمنی را تحریک ‌می‌کند، مقاومت بیماری را بیشتر ‌می‌کند و عملکرد رشد را در ماهی و حلزون صدف دار بهبود می‌بخشد. تحریک پاسخ ایمنی در ماهی از مصرف رژیم غذایی، توجهات زیادی را در آبزی پروری به خود اختصاص داده‌است. براساس دانش ما، این مطالعه اولین تلاش برای بررسی اثرات ایمنوژن به عنوان پری بیوتیک روی بیان ژن، پاسخ ایمنی هومورال و مقاومت به بیماری در ماهی‌های قزل آلای رنگین کمانی است. نتایج مطالعات حاضر نشان می‌دهد که WBC و Htc به طور قابل توجهی در ماهی‌های تغذیه شده با ایمنوژن بالاتر است. مشابه با این نتایج، اضافه کردن 1.5 و 2.5 g/kg از پری بیوتیک ایمنوژن در رژیم غذایی ماهی‌های کپور منجر به افزایش قابل توجه WBC ‌می‌شود و مصرف 0.5 g/kg، میزان Htc را نسبت به سایر گروه‌ها افزایش می‌دهد. سطوح بالاتر WBC مشاهده شده در مطالعه اخیر در اثرات ایمنولوژی احتمالی تمرکز ‌می‌کند که با تنظیم بیش از حد بیان ژن‌های مربوط به ایمنی مربوط است. 
     سیستم ایمنی ذاتی در ماهی‌ها، نقش کلیدی در حفظ ماهی علیه بیماری‌های عفونی دارد. لیزوزیم (مورامیداز، EC 3.2.1.17) یک آنزیم لیز کننده است که پیوندهای گلیکوزیدی را می‌شکند و سطح آن یا فعالیت آن به طور معمول به عنوان یک پارامتر مهم ایمنی ذاتی عمل ‌می‌کند. مصرف 2 g/kg ایمنوژن در مطالعه اخیر، بیان ژن لیزوزیم را بیش از حد تنظیم ‌می‌کند و فعالیت لیزوزیم سرم را در ماهی قزل آلای رنگین کمانی افزایش می‌دهد. هیچ داده منتشر شده‌ای روی اثرات ایمنوژن روی حالت ایمنی ماهی قزل آلای رنگین کمانی ثبت نشده‌است. بنابراین ما نتایج را با مواردی مقایسه می‌کنیم که از مصرف MOS و بتاگلوکان به دست آمده‌است که اصلی‌ترین اجزای ایمنی هستند. در راستای نتایج ما، استایکو و همکارانش، گزارش کردند که مصرف 2 g/kg از MOS فعالیت لیزوزیم را در ماهی قزل آلای رنگین کمانی افزایش می‌دهد. به طور مشابه، لیپوپلی ساکارید باکتریایی (LPS) و تزریق بتا گلوکان، بیان ژن لیزوزیم را در فوق کلیه و فعالیت لیزوزیم سرم را در ماهی قزل آلای آتلانتیک افزایش می‌دهد. 

Abstract

     This study investigates the effects of prebiotic Immunogen® on lysozyme, TNFα and HSP70 gene expression in head kidney, humoral innate immune parameters and resistant to Aeromonas hydrophila of rainbow trout. 120 healthy rainbow trout (81.65 ± 1.49 g) were distributed in six fiberglass tanks assigned to two groups fed control or diet supplemented with 2 g kg−1 Immunogen® for 45 days. The results revealed that administration of Immunogen® significantly (P < 0.05) up regulated lysozyme and TNFα gene expression. HSP70 gene expression was significantly (P < 0.05) lower in Immunogen® fed fish at the end of trial. Humoral innate immune parameters (lysozyme activity, ACH50 and bactericidal activity) were significantly (P < 0.05) increased whether 15 or 45 days after feeding on Immunogen® supplemented diet. However, significant (P < 0.05) increase in agglutination antibody titer observed just after 45 days feeding on Immunogen®. Rainbow trout fed with 2 g kg−1 Immunogen® showed remarkably higher resistance against A. hydrophila (64.44% survival) compared to the control group (24.44% survival). These results confirm that Immunogen® can up regulates immune related genes expression, stimulates immune response that per se enhances disease resistance in rainbow trout.

1. Introduction

     The release of disinfectants and drugs into the rearing water of the intensive fish production system, can affect the integrity of gastrointestinal microbiota [1], decreases growth performance and suppresses the immune responses [2,3]. Also, the administration of antibiotics may results in food and environmental pollutions and development of antibiotic resistant pathogens [4e7]. Along with tremendous growth of world aquaculture during the last years, there was increasing interests toward administration of ecological and environmental friendly approaches like immunestimulants, probiotic and prebiotic as a replacement for antibiotic therapy [8e11].

     Prebiotics are “non-digestible food ingredient that beneficially affects the host by selectively stimulating the growth and/or activity of one or a limited number of bacteria in the colon, and thus improves host health” [12]. The positive effects of prebiotics on immune response and resistance of fish and shellfish is welldocumented [8,9,11,13] and previous studies demonstrated that prebiotics can stimulate both innate immune mechanisms and cells involved in the specific immune response [13e16].

     Immunogen® is a commercial prebiotic, mainly includes bGlucan and mannaoligosaccharides (MOS), derived from Saccharomyces cerevisiae yeast cell wall [17]. MOS and b-glucan have been demonstrated to show beneficial effects on specific and non-specific immune mechanism of monogastric animal [8,17e19]. Ebrahimi et al. [20], reported improved growth performance and immune response of common carp after administration of Immunogen® in diet. Despite recent progress in the field of prebiotic administration in aquaculture [8] there is limited information about the effects of administration of Immunogen® [20] as well as genetic insight into the effects of prebiotics on fish immune system. Thus, the aim of the present study was determination of dietary Immunogen® effects on some hematological parameters, humoral immune response, immune related genes expression (Lysozyme (lyz2), tumor necrosis factor a (TNFa), heat shock protein 70 (HSP70) and resistance of rainbow trout against Aeromonas hydrophila.

4. Discussion

     It is well documented that administrations of dietary prebiotics stimulate immune response, elevate disease resistance and improve growth performance of fish and shellfish [8,11]. Stimulation of the immune response of fish through dietary supplements is of high interest for commercial aquaculture [17]. To our knowledge, this study is the first attempt to investigate the effects of Immunogen® as a prebiotic immune gene expression, humoral immune response and disease resistance of rainbow trout. The results of the present study showed that WBC and Htc were significantly higher in Immunogen® fed fish. Similar to these results inclusion of 1.5 and 2.5 g kg1 prebiotic Immunogen® in common carp diet resulted in significant increase of WBC and administration of 0.5 g kg1 elevated Htc compared to other groups [20]. The higher WBC levels observed in the present study hint at a possible immunomodulatory effect which per se confirmed by upregulation of immune related gene expression.

     Innate immune system in fishes plays a key role in preservation of fish against infectious diseases [10]. Lysozyme (muramidase, EC 3.2.1.17) is a lytic enzyme that hydrolyzes glycosidic bonds and its level or activity has been commonly measured as an important innate immune parameter [33]. Administrations of 2 g kg1 Immunogen® in the present study up-regulated lysozyme gene expression and increased serum lysozyme activity of rainbow trout. There was no published data on the effects of immunogen® on immune statues of rainbow trout. Therefore we compared the results with those obtained from administration of mannanoligosaccharides (MOS) and b-glucan which are the main constitute of Immunogen®. In line with our results, Staykov et al. [18] reported that administration of 2 g kg1 MOS elevated serum lysozyme activity in rainbow trout. Similarly, bacterial lipopolysaccharide (LPS) and beta-glucan injection increased lysozyme gene expression in head kidney and serum lysozyme activity of Atlantic salmon (Salmo salar L.) [34].

(جهت بزرگ نمایی روی عکس کلیک نمایید)

چکیده
1. مقدمه
2. مواد و روش‌ها
2.1. پرورش ماهی و آزمون خوراک دهی
2.2 آماده سازی رژیم
2.3 پارامترهای هماگلوتینین
2.4 بیان ژن‌های مرتبط با ایمنی
2.4.1 سنتز cDNA و استخراج RNA کلی
2.4.2 طراحی پرایمر
2.4.3 Real-time PCR کمی (qPCR)
2.5 ارزیابی‌های ایمنولوژیک
2.6 مقاومت به بیماری
2.7 آنالیزهای آماری
3 نتایج 
4 بحث
منابع

Abstract
1. Introduction
2. Material and methods
2.1. Fish culture and feeding trial
2.2. Diet preparation
2.3. Hematological parameters
2.4. Immune relates genes expression
2.4.1. Total RNA extraction and cDNA synthesis
2.4.2. Primer design
2.4.3. Quantitative real-time PCR (qPCR)
2.5. Immunological assays
2.6. Disease resistance
2.7. Statistical analysis
3. Results
4. Discussion
References