دانلود مقاله بهبود تشخیص مولکولی COVID-19 از طریق آزمایش جدید، بسیار حساس و خاص رونوشت برداری معکوس PCR زمان واقعی COVID-19-RdRp/Hel

چکیده 
     در 31 دسامبر 2019، سازمان بهداشت جهانی از گروهی از موارد واگیردار ناشی از علل ناشناخته در ووهان چین باخبر شد. ارزیابی های بعدی یک کرونا ویروس جدید را شناسایی کردند که در حال حاضر بر اساس بیماران تحت تاثیر قرارگرفته، سندرم شدید حاد تنفسی کرونا ویروس 2 (SARS-CoV-2) نامگذاری شده است. تشخیص های به شدت حساس و خاص آزمایشگاهی برای کنترل سریع اپیدمی بیماری کرونا ویروس مرتبط با SARS-CoV-2 (COVID-19) حائز اهمیت هستند. در این مطالعه، ما عملکرد سه آزمایش جدید رونویسی معکوس در زمان واقعی-PCR (RT-PCR) را توسعه داده و مقایسه کردیم که هدف آن RNA پلیمراز وابسته به RNA، (RdRp)/helicase (Hel), spike (S) و ژن های نوکلئوکپسید (N) SARS-CoV-2 با موارد گزارش شده در آزمون RdRp-P2 بود که در بیش از 30 آزمایشگاه اروپا مورد استفاده قرار می گیرد. در میان این سه آزمایش جدید، تست COVID-19-RdRp/Hel دارای کمترین حد شناسایی در شرایط in vitro است (1.8 از 50% بافت کشت شده از دزهای آلوده شده [TCID50]/ml با RNA ژنومی و 11.2 واکنش/کپی از RNA در رونویسی in vitro در RNA). در میان 273 نمونه حاصل از 15 بیمار که در آزمایشگاه هونگ کونگ از نظر COVID-19 تایید شدند، 77 مورد (28.2%) آن ها از نظر تست COVID-19-RdRp/Hel و RdRp-P2 مثبت بودند. تست RdRp/Hel کووید19 برای 42 نمونه دیگر RdRp-P2-negative نیز مثبت بود (119/273 (43.6%) در مقابل 77/273 (28.2%)؛ P<0.001)، شامل 120/29 (24.2%) نمونه دستگاه تنفسی و 153/13 (8.5 %) نمونه های غیر از دستگاه تنفسی بوده است. میانگین حجم ویروس در این نمونه ها 3.21 ×104 رونوشت RNA/ml است ( در محدوده 2.21 ×102 تا 4.71 ×105 رونوشت RNA/ml). تست COVID-19-RdRp/Hel واکنش متقابلی با سایر کروناویروس های بیماری زای انسانی و عوامل بیماری زای تنفسی در کشت سلولی و نمونه های بالینی ندارد، در حالی که بین تست RdRp-P2 و SARS-CoV در کشت سلولی واکنش متقابل وجود  دارد. تست به شدت حساس و خاص COVID-19-RdRp/Hel ممکن است به بهبود تشخیص آزمایشگاهی COVID-19 کمک کنند.
     در 31 دسامبر 2019، سازمان بهداشت جهانی از گروهی از موارد واگیر یک بیماری ناشناخته در ووهان، استان هوبی در چین خبر داد (https://www.who.int/westernpacific/emergencies/covid-19). ارزیابی بعدی نشاندهنده یک کروناویروس جدید است که ارتباط نزدیکی با سندرم حاد تنفسی کرونا ویروس (SARS_CoV) در این بیماران دارد (1-3). این ویروس جدید اخیراً توسط گروه مطالعاتی کروناویروس در انجمن بین المللی رده بندی ویروس ها به نام سندرم حاد تنفسی کروناویروس 2 نامگذاری شده است (4). بیشتر بیماران مبتلا به آلودگی SARS-CoV-2 یا بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) علائمی از تب شدید، درد عضله، سرفه و شواهد رادیولوژی از کدر شدن زمینه شفاف شش خبر می دهند که قابل مقایسه با بیماری ذات الریه است (5-7). با این وجود، موارد بدون علامت یا علامت خفیف نیز گزارش شده  است (2، 8-10). ارزیابی های اپیدمیولوژی اولیه نشان داد که بازار خرده فروشی غذاهای دریایی هونان در ووهان به عنوان یک منبع مکانی مرتبط بوده، اما ارزیابی اپیدمیولوژی مفصل بعدی نشان داد که بیش از 45% موارد اخیر با بروز علائم قبل از 1 ژانویه 2020 ارتباطی با این بازار نداشتند (5.11). انتقال فرد به فرد در میان تماس نزدیک خانواده و کارکنان بخش مراقبت بهداشتی، از جمله افرادی که سابقه سفر به ووهان را داشتند، گزارش شد (2، 7، 12، 13). در نتیجه خصوصیات بالینی و ارتباط اپیدمیولوژی با ووهان به تنهایی برای تشخیص COVID-19 قابل اتکا نیست.

بحث
     ژنوم مثبت و تک رشته ای RNA در SARS-CoV-2 حدود 30 kb اندازه دارد و حدود 9.860 اسید آمینه را کد می کند (2، 17، 18، 27). مانند سایر بتا کروناویروس ها، ژنوم SARS-CoV-2 طوری مرتب شده است که 5=-replicase (ORF1a/b)-spike (S) واحد (E)-membrane (M)-nucleocapsid (N)-poly(A)-3= را در خود پوشانده است (17). به طور سنتی، هدف های ترجیحی آزمایشات RT-PCR کروناویروس شامل ژن های بیان شده حفاظت شده و/یا فراوانی مانند ژن های ساختاری S و N و غیرساختاری RdRp و ژن های چهارچوب خوانش آزاد(ORF) 1a/b هستند (16.28). برای کووید 19، پروتکل های تعداد آزمایشات RT-PCR مورد استفاده توسط موسسات مختلف به صورت آنلاین در سایت زیر در دسترس است (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus2019/technical-guidance/laboratory-guidance). هدف این آزمایش های ORF1a/b، ORF1bnsp14, RdRp، ژن های S، E یا N موجود در SARS-CoV-2 است و برخی آزمایش های غیر اختصاصی هستند که SARS-CoV-2 و سایر بتاکروناویروس ها مانند SARS-CoV را شناسایی می کنند (20.29).

     مهمتر از آن داده های مورد استفاده در این آزمایش ها، عدم استفاده از تعداد زیادی از نمونه های بالینی حاصل از بیماران تایید شده از نظر COVID-19 است. در این مطالعه، سه آزمایش جدید real-time RT-PCR توسعه داده و ارزیابی شدند که نواحی مختلف ژن را در ژنوم SARS-CoV-2 هدف قرار می دهند. ما نشان دادیم که تست جدید COVID-19-RdRp/Hel به شدت حساس است و مختص شناسایی SARS-CoV-2 RNA در شرایط in vitro و نمونه های بیماران COVID-19 است.
     در میان سه تست ارائه شده در این مطالعه، تست COVID-19-RdRp/Hel کمترین میزان LOD را در رونوشت های RNA ویروسی در شرایط in vitro دارد (11.2 کپی RNA/واکنش؛ 95% فاصله اطمینان؛ 7.2 تا 52.6 کپی RNA/واکنش). LOD در RNA ژنومی نیز بسیار پایین بود (1.8 TCID50/ml). نکته مهم اینکه، تست COVID-19-RdRp/Hel به طور قابل توجهی حساستر (p≤0.001) از تست RdRp-P2 از جهت شناسایی SARS-CoV-2 RNA در هر دو دستگاه تنفسی و غیرتنفسی نمونه های بالینی است. آزمایش COVID-19-RdRp/Hel به شناسایی SARS-CoV-2 RNA در 273/42 (15.4%) نمونه دیگر می پردازد که منفی بودن را از طریق آزمایش RdRp-P2 تست می کنند. این یافته ها بالینی بوده و مرتبط با همه گیری بیماری هستند چون موارد فاقد علامت و با علامت خفیف مووید-19 به طور فزاینده ای شناسایی شده و این بیماران با پنومونی نهفته ممکن است منبع بالقوه برای انتشار اپیدمی باشند (2،8). با توجه به تعداد بیماران (>60.000 مورد در چین در زمان نگارش مقاله) که در این همه گیری گسترده درگیر شده اند، نمونه های مثبت دیگر که توسط تست COVID-19-RdRp/Hel شناسایی شدند ممکن است به صدها نمونه تبدیل شوند که به عبارت دیگر از نظر SARS-CoV-2 منفی بوده و حساسیت کمی در تست RdRp-P2 نشان می دهند.

ABSTRACT

     On 31 December 2019, the World Health Organization was informed of a cluster of cases of pneumonia of unknown etiology in Wuhan, China. Subsequent investigations identified a novel coronavirus, now named severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), from the affected patients. Highly sensitive and specific laboratory diagnostics are important for controlling the rapidly evolving SARS-CoV-2-associated coronavirus disease 2019 (COVID-19) epidemic. In this study, we developed and compared the performance of three novel real-time reverse transcription-PCR (RT-PCR) assays targeting the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)/helicase (Hel), spike (S), and nucleocapsid (N) genes of SARS-CoV-2 with that of the reported RdRp-P2 assay, which is used in 30 European laboratories. Among the three novel assays, the COVID-19-RdRp/Hel assay had the lowest limit of detection in vitro (1.8 50% tissue culture infective doses [TCID50]/ml with genomic RNA and 11.2 RNA copies/reaction with in vitro RNA transcripts). Among 273 specimens from 15 patients with laboratory-confirmed COVID-19 in Hong Kong, 77 (28.2%) were positive by both the COVID-19-RdRp/Hel and RdRp-P2 assays. The COVID-19- RdRp/Hel assay was positive for an additional 42 RdRp-P2-negative specimens (119/ 273 [43.6%] versus 77/273 [28.2%]; P  0.001), including 29/120 (24.2%) respiratory tract specimens and 13/153 (8.5%) non-respiratory tract specimens. The mean viral load of these specimens was 3.21  104 RNA copies/ml (range, 2.21  102 to 4.71  105 RNA copies/ml). The COVID-19-RdRp/Hel assay did not cross-react with other human-pathogenic coronaviruses and respiratory pathogens in cell culture and clinical specimens, whereas the RdRp-P2 assay cross-reacted with SARS-CoV in cell culture. The highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel assay may help to improve the laboratory diagnosis of COVID-19.

     On 31 December 2019, the World Health Organization was informed of a cluster of cases of pneumonia of unknown etiology in Wuhan, Hubei Province, China (https://www.who.int/westernpacific/emergencies/covid-19). Subsequent investigations identified a novel coronavirus that was closely related to severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) from these patients (1–3). This new virus has been recently named severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by the Coronavirus Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses (4). Most patients with SARS-CoV-2 infection, or coronavirus disease 2019 (COVID-19), present with acute onset of fever, myalgia, cough, dyspnea, and radiological evidence of ground-glass lung opacities compatible with atypical pneumonia (5–7). However, asymptomatic or mildly symptomatic cases have also been reported (2, 8–10). Initial epidemiological investigations have indicated the Huanan seafood wholesale market in Wuhan as a geographically linked source, but subsequent detailed epidemiological assessment has revealed that up to 45% of the early cases with symptom onset before 1 January 2020 were not linked to this market (5, 11). Person-to-person transmissions among close family contacts and health care workers, including those without travel history to Wuhan, have been reported (2, 7, 12, 13). Therefore, clinical features and epidemiological links to Wuhan alone are not reliable for establishing the diagnosis of COVID-19.

DISCUSSION

     The positive-sense, single-stranded RNA genome of SARS-CoV-2 is 30 kb in size and encodes 9,860 amino acids (2, 17, 18, 27). Like other betacoronaviruses, the SARS-CoV-2 genome is arranged in the order of 5=-replicase (ORF1a/b)-spike (S)- envelope (E)-membrane (M)-nucleocapsid (N)-poly(A)-3= (17). Traditionally, the preferred targets of coronavirus RT-PCR assays included the conserved and/or abundantly expressed genes such as the structural S and N genes and the nonstructural RdRp and replicase open reading frame (ORF) 1a/b genes (16, 28). For COVID-19, the protocols of a number of RT-PCR assays used by different institutes have recently been made available online (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/ technical-guidance/laboratory-guidance). These assays target the ORF1a/b, ORF1bnsp14, RdRp, S, E, or N gene of SARS-CoV-2, and some are nonspecific assays that would detect SARS-CoV-2 and other related betacoronaviruses such as SARS-CoV (20, 29). Importantly, the in-use evaluation data of these assays using a large number of clinical specimens from patients with confirmed COVID-19 are lacking. In this study, we developed and evaluated three novel real-time RT-PCR assays that target different gene regions of the SARS-CoV-2 genome. We showed that the novel COVID-19-RdRp/Hel assay was highly sensitive and specific for the detection of SARS-CoV-2 RNA in vitro and in COVID-19 patient specimens.

     Among the three assays developed in this study, the COVID-19-RdRp/Hel assay has the lowest LOD with in vitro viral RNA transcripts (11.2 RNA copies/reaction; 95% confidence interval; 7.2 to 52.6 RNA copies/reaction). The LOD with genomic RNA was also very low (1.80 TCID50/ml). Importantly, the COVID-19-RdRp/Hel assay was significantly more sensitive (P  0.001) than the established RdRp-P2 assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA in both respiratory tract and non-respiratory tract clinical specimens. The COVID-19-RdRp/Hel assay detected SARS-CoV-2 RNA in 42/273 (15.4%) additional specimens that tested negative by the RdRp-P2 assay. These findings are clinically and epidemiologically relevant, because asymptomatic and mildly symptomatic cases of COVID-19 have been increasingly recognized, and these patients with cryptic pneumonia may serve as a potential source for propagating the epidemic (2, 8). Given the large number of patients (60,000 cases in China at the time of writing) involved in this expanding epidemic, the additional positive specimens detected by the COVID-19-RdRp/Hel assay might translate into thousands of specimens that would otherwise be considered SARS-CoV-2 negative by the less-sensitive RdRp-P2 assay.

(جهت بزرگ نمایی روی عکس کلیک نمایید)

چکیده 
مواد و روش ها
نتایج
بحث
منابع

ABSTRACT
MATERIALS AND METHODS
RESULTS
DISCUSSION
REFERENCES