دانلود مقاله طراحی پرایمر برای real-time PCR کمی برای کروناویروس SARS-CoV-2 جدید

چکیده
     در دسامبر 2019، یک بیمار کروناویروس جدید (COVID-19) در ووهان چین شیوع پیدا کرد. سندرم کروناویروس-2 حاد تنفسی (SARS-CoV-2) که هفتمین کروناویروس شناخته شده عفونی انسان است، بسیار واگیر بوده و از زمان کشف آن به سرعت در سراسر جهان گسترش یافته است. تست کمی نوکلئیک اسید استانداردی طلایی برای تشخیص و هدایت تصمیمات بالینی با توجه به درمان ضدویروسی است. اگرچه آزمایشات RT-qPCR، SARS-CoV-2 را هدف قرار می دهند دارای چالش هایی نیز هستند، به ویژه در رابطه با طراحی پرایمر. پرایمرها اجزای کلیدی تست RT-qPCR هستند. وقتی جهش ویروسی و بازآرایی رخ می دهد، تشخیص موثر عفونت ویروسی از طریق پرایمرهای RT-qPC موجود دشوار است. برخی پرایمرها و کاوشگرها در وبسایت WHO برای مراجعه وجود دارند. با این وجودف هیچ بررسی سیستماتیکی در مقایسه با پرایمرها و کاوشگرهای گزارش شده از قبل وجود ندارد توضیحی وجود ندارد که پرایمرهای جدید در زمان شیوع آلودگی کرونایروس چطور طراحی می شوند. این مطالعه بر روش و عقلانی بودن نحوه طراحی کاوشگرها و پرایمرها تاکید دارد، و نشان می دهد که چطور حساسیت و اختصاصیت فرایند شناسایی می تواند بهبود پیدا کند. این مطالعه مروری مختصر برای تشخیص صحیح و درمان عفونت کروناویروس جدید مفید است.

مقدمه
     در دسامبر 2019، شیوع بیماری کروناویروس جدید (COVID-19)، که توسط انجمن بین المللی رده بندی ویروس ها نامگذاری شد، در ووهان چین شیوع پیدا کرد. این ویروس سندرم شدید و حاد تنفسی کروناویروس-2 (SARS-CoV-2) نیز نامگذاری می شود (1). SARS-CoV-2 به شدت واگیردار بوده و به سرعت از زمان کشف آن به سراسر دنیا گسترش یافت. از 12 ماه می، 2020، 4.088.848 مورد آلودگی به SARS-CoV-2 در سراسر جهان تایید شده که 283.153 مورد منجر به فوت شده است (2)، با این وجود هنوز هم ممکن است به دلیل آزمایشات ناکافی در بسیاری از کشورها کم تخمین زده شود (3).
     SARS-CoV-2 یک RNA ویروسی پوشش دار، با بار مثبت و تک رشته ای است. دارای ژنوم نسبتاً بزرگی حدود 30 kb است. آرایش ژنومی به صورت ناحیه ترجمه نشده 5′ کمپلکس (UTR) رپلیکاز (ناحیه خوانش آزاد (ORF) 1ab)-پروتئین ساختاری (اسپایک (S)-پوشش (E)-غشا (M)-نوکلئوکپسید (N)[ -3’UTR و ORFهای غیرساختاری است (4). پروتئین S دارای تمایل بالایی به برقراری پیوند با ACE2 انسانی است (5)، این مدت همزمان با زمان انکوباسیون طولانی قبل از بروز علائم است، یعنی SARS-CoV-2 دارای قابلیت انتقال بالا با نرخ مرگ و میر حدود 3% است (6.7). همچنین چالش های قابل توجهی با  توجه به زمان درمان و جلوگیری موثر و کنترل COVID-19 وجود دارد. برای درک بهتر ناحیه SARS-CoV-2 و ارتباط زنتیکی آن با سایر کروناویروس ها، تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک توالی های کروناویروسی از منابع مختلف با استفاده از روش اتصال به مجاور در MEGA X قابل انجام است (8). ژن های ORF 1ab، E و N در میان ساربوکروناویوروس ها بسیار حفاظت شده هستند، که زیر جنس بتاکروناویروس ها هستند. RNA پلیمرازهای وابسته به RNA (RdRp;nsp12) روی ORF 1ab قرار گرفته و نقش حیاتی در سنتز RNA دارند (9.10) و ویژگی آن ها جهش و نوترکیبی سریع است (11). در نتیجه، یک ناحیه حفاظت شده ( ژن هایORF 1ab ، E و N ) معمولاً به عنوان ژن های هدف استاندارد برای طراحی کاوشگر و پرایمر انتخاب می شود (12).
نتیجه گیری
     از آنجا که RT-qPCR یک استاندارد طلایی رایج برای تشخیص علت آلودگی SARS-CoV-2 است، صحت تشخیص این روش باید یک پیش نیاز درجه اول باشد. این بررسی مروری در زمینه اساسی ترین اجزای یک طراحی پرایمر RT-qPCR ارائه می دهد (خلاصه شده در شکل 4). در ابتدا، تشخیص یک توالی مرجع با استفاده از یک فرایند گام به گام و در نهایت مرتب کردن توالی در صورت نیاز، حائز اهمیت است. ژن های هدف شامل N, E, ORF 1ab (or RdRP) و ژن های S هستند. ژن E حفاظت شده هدف آزمایش pan-coronavirus است، در حالی که ژن های N و RdRP عمددتاً به عنوان اهدافی برای آزمایش های تکمیلی عمل می کنند. بعد از در نظر گرفتن نقش های اساسی طرح پرایمر/پروب و از بین رفتن پرایمر/پروب در مقابل SARS-CoV می تواند به عنوان کنترل مثبت استفاده شود؛ علاوه بر این، پرایمرهایی که مسئول تغییر توالی های کرونایروس هستند می توانند ایجاد شوند. ثابت شده است که روش تک منظوره می تواند منجر به نتایج منفی کاذب در محلی شود که در آن توالی هدف جهش یافته است. در نتیجه، تشخیص دو منظوره یا چندمنظوره می تواند برای بهبود حساسیت تشخیص استفاده شود. بعد از اینکه چند جفت از پرایمر طراحی شدند، صرفنظر از اینکه به صورت دستی یا با نرم افزار طراحی شده باشند، تایید بیشتر ضروری است. در تجزیه و تحلیل آزمایشگاهی توالی های پرایمر و پروب لازم است که اختصاصیت مورد تجزیه و تحلیل قرار بگیرد. تنها با ارزیابی توانایی تشخیص پرایمرها و پروب های طراحی شده در تعدادی از نمونه ها ما می توانیم پرایمرها/پروب هایی با حساسیت و اختصاصیت خوب را شناسایی کنیم. علاوه بر این، شرایط واکنش آزمایش، مانند غلظت پرایمرها و پروب ها، Tm و دمای اتصال باید برای حداکثر صحت نتایج بهینه سازی شود.

Abstract

     In December 2019, a new coronavirus disease (COVID-19) outbreak occurred in Wuhan, China. Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), which is the seventh coronavirus known to infect humans, is highly contagious and has rapidly expanded worldwide since its discovery. Quantitative nucleic acid testing has become the gold standard for diagnosis and guiding clinical decisions regarding the use of antiviral therapy. However, the RT-qPCR assays targeting SARS-CoV-2 have a number of challenges, especially in terms of primer design. Primers are the pivotal components of a RT-qPCR assay. Once virus mutation and recombination occur, it is difficult to effectively diagnose viral infection by existing RT-qPCR primers. Some primers and probes have also been made available on the WHO website for reference. However, no previous review has systematically compared the previously reported primers and probes and described how to design new primers in the event of a new coronavirus infection. This review focuses on how primers and probes can be designed methodically and rationally, and how the sensitivity and specificity of the detection process can be improved. This brief review will be useful for the accurate diagnosis and timely treatment of the new coronavirus pneumonia.

Introduction

     In December 2019, outbreak of a new coronavirus disease (COVID-19), defined by the International Committee on Taxonomy of Viruses, occurred in Wuhan, China. This virus has since been named severe acute respiratory syndromecoronavirus-2 (SARS-CoV-2) [1]. SARS-CoV-2 is highly contagious and has rapidly expanded worldwide since its discovery. As of 12 May, 2020, a total of 4,088,848 cases of SARS-CoV-2 infection have been confirmed worldwide with 283,153 deaths [2], although this may be underestimated due to inadequate testing in many countries [3].

     SARS-CoV-2 is an enveloped, positive-sense, single-stranded RNA virus. It possesses a comparatively large genome approaching 30 kb. The genome is arranged in the order of a 5′ untranslated region (UTR)-replicase complex (open reading frame [ORF] 1ab)-structural protein [Spike(S)-Envelope(E)- Membrane (M)-Nucleocapsid (N)]−3′UTR and nonstructural ORFs [4]. The S-protein has a strong binding affinity to human ACE2 [5], and this, along with a long incubation time before manifesting symptoms, means that SARS-CoV-2 has high transmissibility with a mortality rate of approximately 3% [6,7]. This also poses considerable challenges regarding the timely treatment and effective prevention and control of COVID-19. To better understand the origin of SARS-CoV-2 and its genetic relationship with other coronaviruses, phylogenetic analyses of coronavirus sequences from various sources can be performed using the neighbour-joining method in MEGA X [8]. ORF 1ab, E, and N genes are highly conserved among sarbecoviruses, which are a subgenus of betacoronavirus. The RNA-dependent RNA polymerase (RdRp; nsp12) positioned on ORF 1ab plays a crucial role in RNA synthesis [9,10] with features of rapid mutation and recombination [11]. As a result, the conserved regions (ORF 1ab, E, and N genes) are usually selected as the standard target genes for primer and probe design [12].

Conclusion

     As RT-qPCR is the current gold standard for the etiological diagnosis of SARS-CoV-2 infection, the diagnostic accuracy of this technique should be a foremost prerequisite. This review provides an overview of the most crucial components of a RT-qPCR assay-primer design (summarised in Figure 4). First, it is important to identify the reference sequence using a step-by-step process, and eventually align the sequence, if required. The gene targets include the N, E, ORF 1ab (or RdRP), and S genes. The more conserved E gene is the target for the pan-coronavirus assay, while N and RdRP genes mainly function as targets for confirmatory assays. After considering the basic rules of primer/probe design, and degenerate primers/probes against SARS-CoV can be used as a positive control; moreover, primers that account for the variation in coronavirus sequences can be developed. The single-target method is prone to lead to false negative results once a site in the target sequence is mutated. Thus, dual-target or multi-target detection can be additionally used to improve detection sensitivity. After multiple pairs of primers are designed, regardless of whether they are designed manually or by software, further verification is necessary. In silico analysis of primer and probe sequences is needed to analyse the specificity. However, the experimental conformation is more important. Only by evaluating the diagnostic ability of the designed primers and probes on a number of samples, we can identify primers/probes with good sensitivity and specificity. Furthermore, the reaction conditions of the assay, such as the concentration of the primers and probes, Tm, and annealing temperature, must be optimized for maximum accuracy of the results.

چکیده
مقدمه
چند مطالعه در رابطه با فرایند تشخیص SARS-CoV-2
توالی مرجع و از بین رفتن پرایمرهای SARS-CoV-2
ضرورت طراحی یک توالی مرجع
ایجاد توالی مرجع
ضرورت طراحی پرایمرهای از بین رفته
طراحی پرایمرهای از بین رفته
تجزیه و تحلیل پرایمرهای و کاوشگرهای از قبل گزارش شده
مقایسه ژن های هدف: ژن E، ORF 1 ab و ژن N
بهبود حساسیت تست RT-qPCR
اصول کلی استراتژی طراحی پرایمر/کاوشگر
نتیجه گیری
منابع

Abstract
Introduction
Several typical studies regarding the detection process of SARS-CoV-2
Reference sequence and degenerate primers of SARS-CoV-2
Necessity for the design of a reference sequence
Establishing the reference sequence
Necessity for designing degenerate primers
Designing degenerate primers
Analysis of previously reported primers and probes
Comparison of the target genes: E gene, ORF 1ab, and N gene
Improving the sensitivity of the RT-qPCR assay
General principles of primer/probe design strategy
Conclusion
References