جهش های حذف و جایگزینی در دامنه کاتالیزی و منطقه کمربندی گلوکامیلاز آسپرژیلوس آواموری
چکیده
سه جهش تک پس ماند ، Asp71→Asn, Gln409→Pro و Gly447→Ser ، دو جهش جایگزینی حلقه بلند به کوتاه به صورت Gly23-Ala24-Asp25-Gly26-Ala27-Trp28-Val29-Ser30→Asn-Pro-Pro ( 23-30 جایگزینی) و Asp297-Ser298-Glu299-Ala300-Val301→Ala-Gly-Ala ( 297 تا 301 جایگزینی) جهش های حذف کننده که باعث حذف شدن Glu439 ، Thr440 و Ser441 (Δ439–441)) می شود، همه مبتنی بر تراز بندی توالی های آمینو اسید هایی هستند که به منظور افزایش مقاومت و پایداری گرمایی گلوکامیلاز آسپرژیلوس آواموری شکل می گیرند. دو جهش اول و دوم تک پسماندی به صورتی طراحی شده اند تا یک مکان بالقوه گلیکولیزه سازی N ایجاد شود و چرخش پروتئین پشتوانه را محدود کند و ازین رو باعث شود که در طول باز شدن پروتئین ها، میزان انتروپی کاهش پیدا کند. سومین جهش تک پس ماند نیز به این هدف ایجاد می شود که انعطاف کاهش پیدا کرده و میزان گلیکوزیل سازی O در منطقه کمربندی گلیکوزیل شده O افزایش پیدا کند که این قسمت حول دامنه کاتالیزی کروی شکل توسعه پیدا می کند. جهش های 30-23 جایگزینی نیز به صورتی طراحی شده است که یک حلقه قابل توسعه بی ثبات از نظر گرمایی بر روی سطح دامنه کاتالیزی حذف شود و در نتیجه باقی مانده ی این بخش به بقیه ی دامنه کاتالیزی نزدیک تر می شود، در نتیجه مانع باز شدن پروتئین های این قسمت می شود. جهش جایگزینی 301-297 GA نیز به این منظور ایجاد شده است تا بتوان عملکرد منطقه پیچه ای بین آلفا هلیکس 9 و 10 مشخص شود. Δ439–441 نیز به منظور کاهش انعطاف این کمربند ایجاد شده است. تمام این شش جهش ها باعث افزایش پایداری دمایی گلوکومیلاز بدون تغییر محسوس ویژگی های جنبشی آنزیمی می شود و جهش 30-23 باعث افزایش فعال ساز انرژی آزاد برای غیر فعال سازی گرمایی با حدود 4 kJ/mol می شود که منجر به افزایش 4 درجه سانتی گرادی در دمای عملیاتی در پایداری دمایی می شود.
Abstract
Three single-residue mutations, Asp71→Asn, Gln409→Pro and Gly447→Ser, two long-to-short loop replacement mutations, Gly23-Ala24-Asp25-Gly26-Ala27-Trp28-Val29-Ser30→Asn-Pro-Pro (23–30 replacement) and Asp297-Ser298-Glu299-Ala300-Val301→Ala-Gly-Ala (297–301 replacement) and one deletion mutation removing Glu439, Thr440 and Ser441 (Δ439–441), all based on amino acid sequence alignments, were made to improve Aspergillus awamori glucoamylase thermostability. The first and second single-residue mutations were designed to introduce a potential N-glycosylation site and to restrict backbone bond rotation, respectively, and therefore to decrease entropy during protein unfolding. The third single-residue mutation was made to decrease flexibility and increase O-glycosylation in the already highly O-glycosylated belt region that extends around the globular catalytic domain. The 23–30 replacement mutation was designed to eliminate a very thermolabile extended loop on the catalytic domain surface and to bring the remainder of this region closer to the rest of the catalytic domain, therefore preventing it from unfolding. The 297–301 replacement mutant GA was made to understand the function of the random coil region between α-helices 9 and 10. Δ439–441 was constructed to decrease belt flexibility. All six mutations increased glucoamylase thermostability without significantly changing enzyme kinetic properties, with the 23–30 replacement mutation increasing the activation free energy for thermoinactivation by about 4 kJ/mol, which leads to a 4°C increase in operating temperature at constant thermostability.
مقدمه
مواد و روش ها
مواد
بیان و خالص سازی GA
پارامتر های جنبشی و فعالیت های ویژه
غیر فعال سازی های گرمایی غیر قابل بازگشت
جهش گلیکوزی سازی DE-N در Asp71→Asn و نمونه های وحشی GA
طیف جرمی MALDI
نتایج
فعالیت های ویژه و جنبش شناسی GA
پایداری حرارتی GA
گلیکوزی شدن DE-N و طیف جرمی MALDI
مباحث
Abstract
Introduction
Materials and methods
Materials
Results
Discussion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه