بیان دو پروتئین ضد یخ خودافزایشی سوسک Dendroides Canadensis در Arabidopsis thaliana
چکیده
پروتئین های ضد یخ، نقطه انجماد غیر تعادلی محلول های آبی را کاهش می دهند، اما تاثیر کمی روی نقطه ذوب تعادلی دارند. این تفاوت بین نقطه انجماد و نقطه ذوب، فعالیت پسماند حرارتی ( THA) نامیده شده است. فعالیت پسماند حرارتی، حضور و فعالیت نسبی پروتئین ها را نشان می دهد. دو cDNA پروتئین ضد یخ، dafp-1 و dafp-4 که کدکننده ی دو پروتئین ضدیخ خود افزایشی (DAFPs) در سوسک Denodroides Canadensis بودند (با 3 اثر هم افزایی روی فعالیت پسماند حرارتی)، از طریق روش غوطه وری گل آذین با واسطه ی آگروباکتریوم، به ژنوم Arabidopsis thaliana منتقل شدند. تجزیه و تحلیل ساترن بلات، اضافه شدن چندگانه ترانس ژن ها را نشان داد. همانطور که RT-PCR و وسترن بلات نشان دادند، DAFP-4 و/یا DAFP-1 در A. thaliana تراریخته بیان شدند. دامنه فعالیت پسماند حرارتی مایع آپوپلاستیک گیاه A. thaliana تراریخته ی T3 تولید کننده ی DAFP-1 +DAFP-4، در محدوده 2/1- 35/1 درجه سلسیوس بود (با استفاده از روش مویینگی برای تعیین فعالیت پسماند حرارتی) که حضور پروتئین های فعال ضد یخ را نشان می داد (با پپتیدهای سیگنال برای ترشح خارج سلولی). دمای انجماد A. thaliana تراریخته ی تولید کننده ی DAFP-1 +DAFP-4، حدود 2-3 درجه سلسیوس کمتر از نوع وحشی بود.
مقدمه
پروتئین های ضد یخ ( AFPs) نقش مهمی را در مقاومت به سرما در ماهی های خاص، بندپایان زمینی، گیاهان و میکروارگانیسم ایفا می کند (برای مرور مراجعه کنید به: DeVries 1983, 2005; Duman 2001; Davies et al. 2001: Griffith and Yaish 2004; Duman et al, 2010). اگرچه نقطه تعادل انجماد و ذوب محلول های آبی معمولا یکسان بوده و این اصطلاحات به طور مترادف استفاده می شوند، در حضور پروتئین های ضد یخ این چنین نیست. پروتئین های ضد یخ باعث کاهش نقطه غیر تعادلی (پسماند) انجماد در حضور یخ شده اما فقط یک اثر کوچک روی نقطه ذوب می گذارد. تفاوت بین نقطه پسماند انجماد و نقطه پسماند تعادل ذوب، پسماند حرارتی نامیده می شود (DeVries 1986). تصور بر این است که پروتئین های ضد یخ دمای پسماند انجماد را با "جذب و مهار" کاهش می دهند که اولین بار توسط Raymond و DeVries (1977) توصیف شد. آن ها پیشنهاد کردند که پروتئین های ضد یخ به سطح بلور یخ در حال رشد متصل شده، بنابراین سطح بلور یخ تشکیل شده بین پروتئین های ضد یخ بسیار خمیده می شود (سطح بالای انرژی آزاد). با توجه به اثر کلوین، تا زمانی که درجه حرارت به نقطه پسماند انجماد کاهش یابد، رشد بلورهای یخ به تعویق می افتد. انواع مختلفی از برهمکنش های اتصال بین یخ و پروتئین های ضد یخ ارائه شده است. در حالی که پیوند هیدروژنی به عنوان رایج ترین شکل تصور می شود، بر اساس نوع پروتئین های ضد یخ، برهمکنش های آبگریز و نیروهای واندروالسی نیز به عنوان برهمکنش های ممکن گزارش شده اند (Davies et al. 2002; Jia and Davies 2002: Jorov et al 2004).
Abstract
Antifreeze proteins depress the non-equilibrium freezing point of aqueous solutions, but only have a small effect on the equilibrium melting point. This difference between the freezing and melting points has been termed thermal hysteresis activity (THA). THA identifies the presence and relative activity of antifreeze proteins. Two antifreeze protein cDNAs, dafp-1 and dafp-4, encoding two self-enhancing (have a synergistic effect on THA) antifreeze proteins (DAFPs) from the beetle Dendroides canadensis, were introduced into the genome of Arabidopsis thaliana via Agrobacterium-mediated floral dip transformation. Southern blot analysis indicated multiple insertions of transgenes. Both DAFP-1 and/or DAFP-4 were expressed in transgenic A. thaliana as shown by RT-PCR and Western blot. Apoplastic fluid from T3 DAFP-1+DAFP-4-producing transgenic A. thaliana exhibited THA in the range of 1.2– 1.35°C (using the capillary method to determine THA), demonstrating the presence of functioning antifreeze proteins (with signal peptides for extracellular secretion). The freezing temperature of DAFP-1+DAFP-4-producing transgenic A. thaliana was lowered by approximately 2–3°C compared with the wild type.
Introduction
Antifreeze proteins (AFPs) play an important role in the cold tolerance of certain fish, terrestrial arthropods, plants, and microorganisms (for reviews, see DeVries 1983, 2005; Duman 2001; Davies et al. 2002; Griffith and Yaish 2004; Duman et al. 2010). Although the equilibrium freezing and melting points of aqueous solutions are typically identical and the terms are used interchangeably, in the presence of AFPs this is not the case. AFPs depress the non-equilibrium (hysteretic) freezing point, in the presence of ice, but only have a small effect on the melting point. The difference between the hysteretic freezing and equilibrium melting points is termed thermal hysteresis (DeVries 1986). AFPs are thought to lower the hysteretic freezing temperature by “adsorption–inhibition”, first described by Raymond and DeVries (1977). They proposed that AFPs bind to the surface of the growing ice crystal, so the surface of the ice crystal formed between AFPs is highly curved (high surface free energy). Due to the Kelvin effect, the growth of the ice crystal is delayed until the temperature is lowered to the hysteretic freezing point. Several types of binding interactions between ice and AFPs have been suggested. While hydrogen bonding is thought to be the most common form, hydrophobic interactions and van der Waals forces have also been reported as possible interactions, depending on the type of AFP (Davies et al. 2002; Jia and Davies 2002; Jorov et al. 2004).
چکیده
مقدمه
مواد و روش ها
ساخت ناقل
انتقال ناقل های حمل کننده dafp-1 و/یا dafp-4 به آگروباکتریوم
انتقال A. thaliana به روش غوطه وری گل آذین با واسطه آگروباکتریوم
غربالگری اولیه A. thaliana انتقال یافته
غربالگری و تجزیه و تحلیل فعالیت پسماند حرارتی
تجزیه و تحلیل DNA ژنومی توسط ساترن بلات
تجزیه و تحلیل RNA توسط RT-PCR
استخراج پروتئین
وسترن بلات
تجزیه و تحلیل دمای انجماد
روش Real-Time PCRکمی
نتایج
شناسایی گیاهان تراریخته
تجزیه و تحلیل DNA ژنومی در A. thaliana تراریخته
پروفایل های mRNA از DAFP (ها) در A. thaliana تراریخته توسط RT-PCR (نسل T1)
پروفایل های بیان DAFP (ها) در A. thaliana تراریخته توسط وسترن بلات
تجزیه و تحلیل فعالیت پسماند حرارتی
اثر DAFP ها روی دمای انجماد A. thaliana تراریخته
پروفایل های dafps در A. thaliana تراریخته از طریق روش Real-Time PCR
بحث
Abstract
Introduction
Materials and Methods
Vector Construction
Transformation of Vectors Carrying dafp-1 and/or dafp-4 into Agrobacterium
Agrobacterium-mediated Floral Dip Transformation of A. thaliana
Preliminary Screening of the Transformed A. thaliana
THA Screening and Analysis
Genomic DNA Analysis by Southern Blot
RNA Analysis by RT-PCR
Protein Extraction
Western Blot
Freezing Temperature Analysis
Quantitative Real-time PCR
Results
Identification of Transgenic Plants
Genomic DNA Analysis in Transgenic A. thaliana
mRNA Profiles of DAFP(s) in Transgenic A. thaliana by RT-PCR (T1 Generation)
Expression Profiles of DAFP(s) in Transgenic A. thaliana by Western Blot
THA Analysis
The Effect of DAFP(s) on the Freezing Temperature of Transgenic A. thaliana
Profiles of dafps in Transgenic A. thaliana by Quantitative Real-time PCR
Discussion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه