PCR دیجیتال قطره چکانی برای تجزیه و تحلیل معمول غذاهای اصلاح شده ژنتیکی
چکیده
کاربرد واکنش زنجیره ای پلیمراز دیجیتال قطره چکانی (ddPCR) به تازگی در تجزیه و تحلیل نمونه های غذایی و خوراک اصلاح شده ژنتیکی (GM) افزایش یافته است. در حالی که روش real-time PCR کمی (qPCR)، تا به حال تکیه گاه اصلی سنتی بوده اند، کاربری ddPCR در آنالیز غذا و خوراک GM هنوز به طور گسترده انجام نشده است. در این بررسی، ما ddPCR را برای نمونه های غذا و خوراک GM به کار بردیم، که این نمونه ها اخیرا روی پلت فرم qPCR در آزمایش های تخصصی بین آزمایشگاهی آزمایش شده و عملکرد خوب روش ddPCR را نشان دادند. گاهی اوقات DNA محصولات تراریخته در سطوح مختلف ژن، به عنوان ماده مرجع، به راحتی در دسترس نیست. در زمان کاربرد ddPCR، غلظت های مختلف مواد تراریخته، DNA اختصاصی تراریخته در سطوح مختلف (1/0-10%) به عنوان DNA مرجع مفید، به ترتیب از مواد 100% غیر تراریخته و مواد گیاهی 100% تراریخته به دست آمد و پارامترهای کلیدی عملکرد روش ddPCR ارزیابی شده است. DdPCR به خوبی انجام شد که نشان دهنده ی مناسب بودن آن برای تولید مواد مرجع تراریخته است. در یک تجزیه و تحلیل گسترش یافته، DNA استخراج شده از گیاه سویای مرجع 100% تراریخته (CV127) به طور مناسب به تعداد کمی کپی رقیق شد و LOD95% مطلق در دو کپی (ارزش اسمی) تعیین شد و به خوبی با روش های مختلف منتشرشده ی qPCR مقایسه شد. در بررسی های بازدارندگی ما، ddPCR مزیت واضحی را نسبت به qPCR در نمونه های مهار شده با SOS نشان داد، درحالی که مقاومت آن به بازدارنده های آزمایش شده قابل مقایسه با qPCR بود. روش های qPCR، به طور معنی دار، با EDTA به عنوان بازدارنده، تکثیر/مهار نامتقارن تری را نشان داد و بازدارندگی در واکنش های مرجع و تراریخته نامساوی بود، در حالی که بازدارندگی در پلت فرم ddPCR، متقارن تر بود. در نهایت، یک پانل از مواد مرجع مثبت با محتوای GM متغیر از 1/0 تا 10%، روی پلت فرم ddPCR ارزیابی شد و پارامترهای مربوط به کارایی یعنی دقت، صحت و درستی نتایج، با عملکرد خوب روش مورد بررسی قرار گرفت.
1- مقدمه
تجزیه و تحلیل غذاها و خوراک اصلاح شده ژنتیکی (GM) در زمان های اخیر افزایش یافته است. در حالی که فهرستی از غذاهای GMO مورد تایید اتحادیه ی اروپا همچنان رو به رشد است، تحلیلگران غذا و خوراک دائما در حال تحول استراتژی های تشخیصی (غربالگری) و کنترلی برای تحمل تقاضاهای تحلیلی افزایش یافته اند. در حال حاضر، استاندارد طلایی در تشخیص و کمی سازی حوادث GMO در مواد غذایی و خوراک، واکنش زنجیره ای پلیمراز Real-Time کمی (qPCR) است. در واقع، چندین روش qPCR برای تجزیه و تحلیل GM، با یا بدون تعیین کمیت، تا به امروز منتشر شده است (Holst-Jensen, 2009; Koppel, Bucher, Meuwly, & Moor, 2014; Koppel, Zimmerli, & Breitenmoser, 2010, European Union Refer ence Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF)). در حالی که بسیاری از این آزمایش ها تایید و به عنوان واکنش های singleplex کاربردی شده است، تعداد فزاینده ای از سنجش های مولتی پلکس، در سال های اخیر برای تشخیص و کمی سازی همزمان چندین رویداد GM توصیف شده اند (Koppel, Velsen, Felderer, & Bucher, 2012; Park, Kim, & Kim, 2015; Shin et al., 2013; Wang, Teng, Guan, Tian, & Wang, 2015). اگر چه بیشتر روش های qPCR نتایج خوبی را با سطوح دقت قابل قبول تولید می کند، این روش های برای تعیین محتوای GMO ناشناخته، به استفاده از منحنی های استاندارد وابسته اند. از طرف دیگر با ddPCR، محتوای GM می تواند از طریق اندازه گیری پیوسته ی نسبت ژن تراریخته به ژن مرجع در نمونه مورد بررسی، با استفاده از منحنی های استاندارد، به صورت دو واکنش singleplex در یک اجرای آنالیزی یا در یک سیستم دوپلکس ترکیبی تعیین شود.
abstract
Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) has seen increasing applications in recent times, also in the analysis of genetically modified (GM) food and feed samples. While quantitative real-time PCR (qPCR) methods have been traditional mainstays till now, the applicability of ddPCR in routine analysis of GM food and feed has not yet been widely demonstrated. In this work, we applied ddPCR on selected GM-food and feed samples that were recently analyzed on the qPCR platform in inter-laboratory proficiency tests and showed good performance of the ddPCR method. Sometimes GM DNA at different transgene levels, useful as reference material is not readily available. Applying ddPCR, different concentrations of GM material, specifically transgene DNA at different levels (0.1e10%) useful as reference DNA, were generated from 100% non GM material and 100% transgene plant material respectively, and key performance parameters of the ddPCR assay evaluated. DdPCR performed well, indicating its suitability for the production of reference GM materials. In an expanded analysis, DNA extracted from a 100% GM reference soy plant (CV127) was appropriately diluted to low copy numbers and the absolute LOD95% determined at 2 copies (nominal value), comparing well with various published qPCR assays. In our inhibition studies, ddPCR showed a clear advantage over qPCR in SDS-inhibited samples, while its tolerance to other tested inhibitors was comparable with qPCR. Significantly, the qPCR assays demonstrated more asymmetrical amplification/inhibition with EDTA as inhibitor, with unequal inhibition in reference and transgene reactions, while inhibition was more symmetrical on the ddPCR platform. Finally, a panel of positive reference material with varying GM content from 0.1 to 10% were evaluated on the ddPCR platform and pertinent performance parameters assessed, namely, precision, accuracy and trueness of results, with good performance of the assay.
1. Introduction
The analysis of genetically modified (GM) foods and feed has seen an increased surge in recent times. While the list of EUapproved GMO foods continues to grow, food and feed analysts are constantly evolving new detection (screening) and control strategies to keep up with the increasing analytical demands. Currently the gold standard in the detection and quantification of GMO events in food and feed is the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). Indeed several qPCR assays for GM analysis, with or without quantification, have been published to date (Holst-Jensen, 2009; Koppel, Bucher, Meuwly, € & Moor, 2014; Koppel, Zimmerli, € & Breitenmoser, 2010, European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed (EURL-GMFF). While the majority of these assays are validated and applied as singleplex reactions, an increasing number of multiplex assays, detecting and quantifying simultaneously several GM events, have been described in recent years (Koppel, Velsen, Felderer, € & Bucher, 2012; Park, Kim, & Kim, 2015; Shin et al., 2013; Wang, Teng, Guan, Tian, & Wang, 2015). Although most qPCR approaches generate reasonably good results with acceptable levels of precision, they usually rely on the use of standard curves for the determination of unknown GMO content. With ddPCR on the other hand, GM content can be determined by measuring concomitantly the ratio of transgene relative to reference gene in the sample under investigation without using standard curves, either as two singleplex reactions in the same analytical run or in a combined duplex system.
چکیده
1-مقدمه
2- مواد و روش ها
2-1- نمونه ها
2-2- استخراج DNA
2-3- الیگونوکلئوتیدها
2-4- ddPCR
2-5- qPCR
2-6- تجزیه و تحلیل داده
2-7- روش های بازدارنده PCR
2-8- بررسی مواد GM مرجع
2-9- تولید غلظت های مختلف از مواد GM
3- نتایج و بحث
3-1- تجزیه و تحلیل ddPCR نمونه های حاوی درصدهای مختلف از مواد گیاهی GM
3-2- تایید محتوای GM چندین ماده مرجع GM
3-3- تاثیر بازدارنده ها بر PCR با استفاده از real-time و پلت فرم های دیجیتال قطره ای
3-4- ddPCR روی پلت فرم دوبلکس
3-5- ddPCR برای تولید غلظت های مختلف GMO
4- نتیجه گیری
abstract
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1. Samples
2.2. DNA extraction
2.3. Oligonucleotides
2.4. ddPCR
2.5. qPCR
2.6. Analysis of data
2.7. PCR-inhibition assays
2.8. Verification of GM reference material
2.9. Production of different concentrations of GM material
3. Results and discussion
3.1. ddPCR analysis of samples containing varying percentages of GM plant material
3.2. Verification of the GM content of several GM reference materials
3.3. Impact of inhibitors on PCR employing real-time and droplet digital platforms
3.4. ddPCR on a duplex platform
3.5. ddPCR for the generation of different GMO-concentrations
4. Conclusion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه