مقایسه تحویل RNA کوچک مداخله گر (siRNA) با ماکروفاژ های مشتق شده از مونوسیت گاوی
چکیده
دستکاری مسیر تداخل RNA با استفاده از RNA کوچک مداخله گر (siRNA) اغلب به عنوان روش خاموشی ژن مورد استفاده قرار گرفته است. با این حال، تحویل siRNA به سلول های اولیه، به ویژه ماکروفاژهای اولیه، اغلب چالش برانگیز است. در اینجا بررسی مناسب بودن دو روش انتقال موقت و الکتروپوریشن، برای تحویل siRNA مورد نظر علیه ژن معروف تنظیم ایمنی تب مدیترانه ای (MEFV ) به ماکروفاژ های مشتق شده از مونوسیت های گاوی ( bMDM) گزارش است. یازده معرف ترانسفکشن تجاری با نتایج متفاوت در ارتباط با جذب siRNA، از کار انداختن ژن مورد نظر، سمیت سلولی و القای پاسخ اینترفرون نوع I (IFN ) مورد بررسی قرار گرفتند. سه معرف ترانسفکشن: لیپوفکتامین 2000، لیپوفکتامین RNAiMAX و DharmaFECT 3 بهترین نتایج را ارائه دادند. با این حال، تمام معرف های ترانسفکشن بررسی شده، یک پاسخ IFN را در غیاب siRNA القا می کردند که می تواند با کاهش دوره انکوباسیون معرف ترانسفکشن به حداقل برسد. علاوه بر این، تحویل بهینه سازی شده ی siRNA به bMDM از طریق الکتروپوراسیون، سطوح قابل مقایسه ای از از کار انداختن ژن را به عنوان ترانسفکشن موقت، بدون یک پاسخ قابل تشخیص IFN، و سطوح بالاتر سمیت سلولی را ارائه داد. روش های ترانسفکشن و الکتروپوریشن گذرای بهینه شده ممکن است باعث ایجاد یک نقطه شروع برای بهینه سازی تحویل siRNA به ماکروفاژهای مشتق شده از سایر گونه ها یا سایر سلول ها شود که بررسی siRNA در آن ها دشوار است.
مقدمه
کشف مسیر تداخل RNA (RNAi) که در آن RNA دو رشته ای (dsRNA) باعث خاموشی بیان ژن پس از رونویسی شده (Fire et al., 1998) و پس از آن بیان اینکه این مسیر می تواند با توالی های RNA اگزوژن کوتاه مورد استفاده قرار گیرد (Elbashir et al., 2001)، باعث ایجاد انقلاب در بسیاری از حوزه های مطالعات سلولی شده است. مسیر RNAi از نظر تکاملی حفاظت شده بوده و در گیاهان، قارچ ها و سلول های حیوانی وجود دارد و چندین عملکرد از جمله حفظ سلول ها از dsRNA ویروسی و ترانسپوزون ها، و همچنین تنظیم بیان ژن از طریق تخریب mRNA، اصلاح کرومتاتین و سرکوب ترجمه دارد (مرور شده توسط Dykxhoorn and Lieberman, 2005). در سیتوپلاسم سلول، میکرو RNA درون زاد (miRNA ) یا dsRNA اگزوژن توسط پروتئین Dicer به RNA مداخله گر کوتاه با 21-23 نوکلئوتید (siRNA ) پردازش شده و با کمپلکس خاموشی ناشی از RNA چند واحدی (RISC ) ترکیب می شود. رشته های RNA از هم جدا شده و رشته آنتی سنس (راهنما) به mRNA با توالی مکمل متصل شده که بسته به اندازه مکمل توالی، منجر به شکست mRNA یا سرکوب ترجمه می شود (مرور شده توسط Shan, 2010).
abstract
The manipulation of the RNA interference pathway using small interfering RNA (siRNA) has become the most frequently used gene silencing method. However, siRNA delivery into primary cells, especially primary macrophages, is often considered challenging. Here we report the investigation of the suitability of two methodologies: transient transfection and electroporation, to deliver siRNA targeted against the putative immunomodulatory gene Mediterranean fever (MEFV) into primary bovine monocyte-derived macrophages (bMDM). Eleven commercial transfection reagents were investigated with variable results with respect to siRNA uptake, target gene knock-down, cell toxicity and type I interferon (IFN) response induction. Three transfection reagents: Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX and DharmaFECT 3, were found to consistently give the best results. However, all the transfection reagents tested induced an IFN response in the absence of siRNA, which could be minimized by reducing the transfection reagent incubation period. In addition, optimized siRNA delivery into bMDM by electroporation achieved comparable levels of target gene knock-down as transient transfection, without a detectable IFN response, but with higher levels of cell toxicity. The optimized transient transfection and electroporation methodologies may provide a starting point for optimizing siRNA delivery into macrophages derived from other species or other cells considered difficult to investigate with siRNA.
1. Introduction
The discovery of the RNA inference (RNAi) pathway, where double-stranded RNA (dsRNA) posttranscriptionally silences gene expression (Fire et al., 1998) and the subsequent demonstration that this pathway could be utilized with short, exogenous RNA sequences (Elbashir et al., 2001) have revolutionized many areas of cellular research. The RNAi pathway is evolutionary conserved, being present in plants, fungi and animal cells, and has multiple functions; protecting cells from viral dsRNA and transposons, as well as regulating gene expression by the degradation of mRNA, translational repression and chromatin modifications (reviewed by Dykxhoorn and Lieberman, 2005). In the cell cytoplasm, endogenous microRNA (miRNA) or exogenous dsRNA are typically processed into 21–23 nucleotide short interfering RNA (siRNA) by the Dicer protein and integrated into the multi-subunit RNA-induced silencing complex (RISC). The RNA strands are separated and the antisense (guide) strand binds mRNA with complementary sequence, resulting in mRNA cleavage or translational repression, depending on the extent of sequence complementarity (reviewed by Shan, 2010).
چکیده
1.مقدمه
2. مواد و روش
2.1. آماده سازی ماکروفاژهای مشتق شده از مونوسیت گاوی (bMDM)
2.2. siRNA دورشته ای
2.3. ترانسفکشن
2.4. الکتروپوریشن
2.5. تعیین کمیت جذب و سمیت سلولی siRNA
2.6. تجزیه و تحلیل RT-PCR کمی از کار افتادن ژن هدف و پاسخ اینترفرون
3. نتایج و بحث
3.1. تحویل siRNA توسط معرف های ترانسفکشن
3.2. تحویل siRNA توسط الکتروپوراسیون
3.3 نتیجه گیری
abstract
1. Introduction
2. Materials and methods
2.1. Preparation of bovine monocyte-derived macrophages (bMDM)
2.2. siRNA duplexes
2.3. Transfection
2.4. Electroporation
2.5. Quantification of siRNA uptake and cytotoxicity
2.6. Quantitative (q)RT-PCR analysis of target gene knock-down and interferon response
3. Results and discussion
3.1. Delivery of siRNA by transfection reagents
3.2. Delivery of siRNA by electroporation
3.3. Conclusions
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه