کشت های ریشه مویین و باززایی گیاه در Solidago nemoralis ترنسفورم شده
چکیده
با غربالگری کتابخانه ی عصاره های گیاهی بومی، Solidago nemoralis به عنوان یک منبع جدید آگونیست گیرنده های نیکوتینی alpha7 استیل کولین با پتانسیل درمانی شناخته شد. مرحله بعدی استراتژی کشف دارو، افزایش بازده ترکیبات فعال در گونه های گیاهی با پیشرفت جهش عملکردی در کشت ریشه مویین است [1]. در اینجا یک پروتکل برای تراریخت کردن ژنتیکی کشت های ریشه های مویین Solidago nemoralis با واسطه ی آگروباکتریوم ریزوژنس گزارش شده است. ریزنمونه های برگی این گونه به طور موفق با فراوانی 30٪ - 35٪ با استفاده از آگروباکتریوم ریزوژنس سویه ی R1000 دارای ناقل pCambia 1301 تراریخت شد. تراریخت سازی با استفاده از روش هیستوشیمی بتا-گلوکورونیداز (GUS) تایید شد. در ریشه های مویین تراریخت، بازسازی خود به خودی شاخه های نابجا در محیط بدون افزودن سیتوکین ها، البته در فراوانی خیلی کم مشاهده شد. با این حال، افزودن اکسین به محیط (آلفا –نفتالن استیک اسید، NAA) باعث افزایش فراوانی بازسازی ساقه ها تا 35٪ و در نتیجه ایجاد شاخه های نایه جای قابل دوام شد. تراریخت سازی در تمام مراحل باززایی گیاه از طریق رنگ آمیزی GUS تایید شد. تراریخت سازی ریشه مویین Solidago altissima قبلا گزارش شده، اما این اولین گزارش از تراریخت سازی ژنتیکی S. nemoralis است. این پروتکل باعث فعال سازی موتانت های برچسب دار در جمعیت بزرگی از S. nemoralis شده که به نوبه خود از نظر حضور موتانت های پایدار غربال شدند که این موتانت ها باعث تولید بیش از حد متابولیت های فعال در گیرنده های نیکوتینی آلفا7 می شوند. پس از این، کشت های این موتانت ها به گیاهان موتانت دست نخورده بازسازی شدند.
مقدمه
گیاهان دارای تشکیلات بیوسنتزی پیچیده ای هستند که باعث تکامل متابولیت های ثانویه زیست فعال، پیچیده و چند منظوره برای محافظت از محرک های تنش زا می شود. یکی از نمونه ها، آلکالوئید متیل لیکاکونیتین (MLA) در گونه Delphinium است که با هدف قرار دادن گیرنده نیکوتینی حشرات برای استیل کولین (nAChR) (شایع ترین گیرنده ی تحریکی در سیستم عصبی مرکزی حشرات) مانع از حشرات گیاه خوار می شود (2). متیل-لیکاکونیتین علاوه بر اینکه یک لیگاند با میل ترکیبی بالا برای استیل کولین حشرات است، همچنین یک لیگاند بسیار انتخابی برای زیر گروه alpha7 استیل کولین انسان است [3]. از آنجا که این گیرنده یک هدف در حال ظهور برای درمان اختلالات عصبی است [4]، سایر متابولیت های گیاهی با این انتخابی بودن می توانند از نظر درمانی مورد توجه باشند. بنابراین یک کتابخانه گیاهان بومی برای این فعالیت دارویی با استفاده از روش "غربالگری افتراقی" غربال شده [1] که باعث شناسایی Solidago nemoralis ( "gray goldenrod") به عنوان نامزد نخستین شد که فعالیت آن، پیش از این مورد بررسی قرار نگرفته بود. با این حال، در سایر گونه های گیاهی با چرخه های بلند رشدی، عملکرد پایین و ضرورت برداشت مقادیر زیاد بیومس، به احتمال زیاد مانع توسعه و تجاری سازی این متابولیت ها شده است. تعدادی از استراتژی های مهندسی زیستی برای دور زدن این مسائل برای متابولیت های شناخته شده با مسیرهای متابولیک شناخته شده شرح داده شده است [5]. با این حال، در مورد متابولیت های ناشناخته با مسیرهای ناشناخته برای تولید (مانند اینجا) یک استراتژی جایگزین برای بهینه سازی تولید گیاه مورد نیاز است. استراتژی موجوده در آزمایشگاه ما بر کشت مستمر ریشه های مویین با واسطه ی آگروباکتریوم همراه با جهش زایی تصادفی تکیه دارد. موتانت های پایدار تولید کننده ی بیش از حد متابولیت های فعال، از طریق غربالگری دارویی مشخص شده و سپس به گیاهان موتانت دست نخورده بازسازی می شوند. با این حال، برای جنس Solidago، تنها یک گونه یعنی S. altissima، گزارش شده است که توسط آگروباکتریوم تراریخت می شود [6]. در اینجا یک پروتکل انتقال با واسطه ی آگروباکتریوم برای S. nemoralis گزارش شده است که استفاده از استراتژی بهینه سازی ژنومی را برای ترکیبات درمانی بالقوه موجود در این گونه فعال می کند.
ABSTRACT
By screening a native plant extract library we identified Solidago nemoralis as a novel source of agonists for alpha7 nicotinic receptors for acetylcholine with therapeutic potential. The next phase of our drug discovery strategy is to increase the yields of active compounds in the plant species by gain of function mutations in hairy root cultures [1]. Here we report a protocol for Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation of hairy root cultures of Solidago nemoralis which will enable this. Leaf explants of this species were successfully transformed with a frequency of 30% - 35% using A. rhizogenes strain R1000 harboring the binary vector pCambia 1301. Transformation was confirmed using the β-glucuronidase (GUS) histochemical assay. Transformed hairy roots showed spontaneous regeneration of adventitious shoots in media without the addition of cytokines, albeit at very low frequency. However, media supplementation with auxin (α-naphthaleneacetic acid, NAA) increased shoot regeneration frequency to 35% and resulted in viable adventitious shoots. Transformation was confirmed at all phases of plant regeneration by GUS staining. Hairy root transformation of Solidago altissima has been previously reported, but this is the first report of genetic transformation of S. nemoralis. The protocol will allow for a large population of activation tagged mutants of S. nemoralis to be generated which will be then screened for the presence of stable mutants which are over-producing metabolites with activity at alpha7 nicotinic receptors. These over-producing mutant cultures will then be regenerated into intact mutant plants.
1. Introduction
Plants have complex biosynthetic machineries that have allowed them to evolve bioactive, complex and multifunctional secondary metabolites as protection against stressors. One example is the complex alkaloid methyllycaconitine (MLA) in Delphinium species which deters herbivorous insects by targeting the insect nicotinic receptor for acetylcholine (nAChR), the most prevalent excitatory receptor in the insect CNS [2]. In addition to being a high affinity ligand for the insect nAChR, MLA is also a highly selective ligand for the alpha7-subtype of human nAChR [3]. Since this receptor is an emerging target for the treatment of neurodegenerative disorders [4] other plant metabolites with this selectivity would be of considerable therapeutic interest. We therefore screened a native plant library for this pharmacological activity using a “differential screening” approach [1] which identified Solidago nemoralis (“gray goldenrod”) as a prime candidate which has not previously been investigated for this activity. However, as for other plant species, long grow cycles, low yield and necessity to harvest large amounts of biomass, is likely to hinder the development and commercialisation of these metabolites. A number of bioengineering strategies to circumvent these issues have been described for known metabolites with known metabolic pathways [5]. However, in the case of unknown metabolites with unknown pathways for production (as here) an alternative strategy for optimizing plant production is required. The strategy developed in our laboratory relies on Agrobacteriummediated continuous hairy root culture together with random gain-of-function mutagenesis. Stable mutants over-producing the active metabolites are identified by pharmacological screening, and are then regenerated into intact mutant plants. However, for the Solidago genus, only one species, S. altissima, has been reported to be transformed by Agrobacterium [6]. Here we report an Agrobacterium-mediated transformation protocol for S. nemoralis, which will enable the application of our genomic optimization strategy to the potential therapeutic compounds contained in this species.
چکیده
1.مقدمه
2. مواد و روش ها
2.1. مواد گیاهی و شرایط کشت
2.2. کشت آگروباکتریوم و آلوده سازی
2.3. باززایی گیاه از ریشه های مویین
2.4. روش هیستوشیمیایی P- گلوکورونیداز (GUS)
3. نتایج
4. بحث
ABSTRACT
1. Introduction
2. Materials and Methods
2.1. Plant Material & Culture Conditions
2.2. Agrobacterium Culture and Infection
2.3. Plant Regeneration from Hairy Roots
2.4. β-Glucuronidase (GUS) Histochemical Assay
3. Results
4. Discussion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه