یک مسیر ترشحی بالقوه جدید برای پروتئین های نوترکیب در باسیلوس سوبتیلیس
چکیده
پیش زمینه: ترشح پروتئین های بیان شده سیتوپلاسمی در محیط کشت فواید مهمی دارد. به دلیل فقدان غشا خارجی، باسیلوس سوبتیلیس به عنوان کارخانه سلولی دلخواه برای ترشح پروتئین های نوترکیب در نظر گرفته شده است. اگرچه، در مسیر کلاسیک برای ترشح پروتئین ها تنگناهایی وجود دارد که استفاده از آن به طور وسیع را محدود می کند. در این مطالعه، ما تلاش کردیم از چهار پروتئین ترشحی از مسیر غیر کلاسیک به عنوان سیگنال هایی برای انتقال سه پروتئین به محیط کشت استفاده کنیم.
نتایج: همه چهار پروتئین ترشحی از مسیر غیر کلاسیک می توانند خروج پروتئین مشابه اسکلت هسته با اختلال ذاتی(Nsp) را هدایت کنند. دو مورد از آنها توانایی هدایت آلکالین فسفاتاز(PhoA) را دارند. فقط یکی از آنها می تواند ترشح بتا گالاکتوزیداز مقاوم به حرارت (BgaB) را هدایت کند، که توانایی انتقال توسط پپتید سیگنالی وابسته به Sec را ندارد.
نتیجه گیری: نتایج ما نشان می¬دهد که پروتئین های ترشحی از مسیر غیر کلاسیک سبب هدایت پروتئین های نوترکیگب به محیط کشت می¬شود و بنابراین مسیر ترشح غیر کلاسیک پروتئین می تواند به عنوان مسیر ترشحی جدید برای پروتئین های نوترکیب استفاده شود.
پیش زمینه
اگر پروتئین مورد نظر در محیط کشت ترشح شود، خالص سازی پروتئین تا حد زیادی آسان می شود؛ چون بازیابی این پروتئین ها آلودگی حاصل از پروتئین میزبان را کاهش می دهد. به دلیل ضرورت فناوری DNA نوترکیب، تلاش های فراوانی برای استفاده از سیستم های ترشحی به منظور انتقال پروتئین های نوترکیب به محیط کشت، انجام گرفته است (4-1). پروتئین ها در باکتری های گرم مثبت نسبت به باکتری های گرم منفی آسانتر به محیط خارج سلولی ترشح می شوند؛ چون این پروتئین ها فقط نیاز دارند از غشا سیتوپلاسمی عبور کنند تا به فضای خارج سلولی برسند. بنابراین باکتری های گرم مثبت به ویژه باسیلوس سوبتیلیس به طور وسیعی برای تولید پروتئین های نوترکیب مورد آزمایش قرار گرفته است (9-5). مزیت استفاده از باسیلوس سوبتیلیس نسبت به بقیه باکتری ها، شامل ...، توانایی ترشح بالا، قابلیت تغییر ژنتیکی، فناوری تخمیر بالا، شناخته شدن به عنوان عامل ایمن و عدم استفاده از کدون مشابه در توالی، که این باکتری را به مناسب ترین میزبان و به عنوان کارخانه سلولی برای تولید پروتئین های ترشحی متفاوت تبدیل کرده است (6).
Abstract
Background: Secretion of cytoplasmic expressed proteins into growth media has significant advantages. Due to the lack of an outer membrane, Bacillus subtilis is considered as a desirable ‘cell factory’ for the secretion of recombinant proteins. However, bottlenecks in the classical pathway for the secretion of recombinant proteins limit its use on a wide scale. In this study, we attempted to use four typical non-classically secreted proteins as signals to export three recombinant model proteins to the culture medium.
Results: All four non-classically secreted proteins can direct the export of the intrinsically disordered nucleoskeletallike protein (Nsp). Two of them can guide the secretion of alkaline phosphatase (PhoA). One can lead the secretion of the thermostable β-galactosidase BgaB, which cannot be secreted with the aid of typical Sec-dependent signal peptides.
Conclusion: Our results show that the non-classically secreted proteins lead the recombinant proteins to the culture medium, and thus non-classical protein secretion pathways can be exploited as a novel secretion pathway for recombinant proteins.
Background
The downstream processing of proteins is greatly facilitated if the protein of interest is secreted into the culture medium, because recovery of these proteins minimises contamination from host proteins. Since the emergence of recombinant DNA technology, numerous efforts have been made to exploit secretion systems to export recombinant proteins into the culture medium [1–4]. Proteins are more easily exported into the extracellular medium of Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria, because these proteins need only cross the cytoplasmic membrane to reach the extracellular environment. Thus, Gram-positive bacteria particularly Bacillus subtilis has been extensively tested for the production of recombinant proteins [5–9]. The advantages of using B. subtilis over other bacteria make it one of the most promising hosts for the production of heterologous secretory proteins. These advantages include simplified downstream processing, powerful secretion ability, amenableness to genetic modification, mature fermentation technology, ‘generally recognised as safe’ (GRAS) status, and nonbiased codon usage [6].
چکیده
پیش زمینه
نتایج
ترشح Nsp با ساختار نامنظم توسط پروتئین های ترشحی از مسیر غیر کلاسیک
موقعیت یابی ترکیب PhoA و پروتئین های ترشحی از مسیر غیر کلاسیک
موقعیت یابی ترکیب BgaB و پروتئین های ترشحی از مسیر غیر کلاسیک
بحث
نتیجه گیری
روش کار
سویه های باکتریایی، پلاسمیدها و شرایط رشد
ساخت پلاسمید
ترانسفورماسیون DNA
الکتروفورز ژل و وسترن بلاتینگ
ارزیابی های آنزیمی
Abstract
Background
Results
Secretion of unstructured Nsp with non‑classically secreted proteins
Localisation of PhoA fusions to non‑classically secreted proteins
Localisation of BgaB fusions to non‑classically secreted proteins
Discussion
Conclusions
Methods
Bacterial strains, plasmids, and growth conditions
Plasmid construction
Transformation of DNA
Gel electrophoresis and western blotting
Enzymatic assays
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه