مهارکردن دیواره سلولی آنتی ژن های کمپیلوباکتر در برابر لاکتوکوکوس لاکتیس

باکتری کمپیلوباکتری ژژونی اصلی ترین عامل بیماری باکتریایی گاستروانتریت ناشی از غذا در انسان و گوشت مرغ منبع اصلی عفونت می باشد. مطالعات اخیر نشان می دهد که ایمن سازی مرغ ها علیه کمپیلوباکتر موثرترین راه برای کاهش موارد ابتلای انسانی به این عامل بیماری زا می باشد. القای سیستم ایمنی مخاطی پس از استفاده از آنتی ژن، بایستی مرغ ها را ایمن سازد. در این مطالعه ما کارایی لاکتوکوکوس لاکتیس که بیشترین مطالعه در بین لاکتیک اسید باکتری ها بر روی آن انجام شده، را به منظور استفاده به عنوان وکتور انتقال آنتی ژن های کمپیلوباکتر ژژونی مورد بررسی قرار دادیم. در ابتدا پروتئین هیبرید ساخته شد که آنتی ژن CjaA سه اپی توپ مربوط به آنتی ژن CjaD را بر روی سطح خود نشان می دهد.  ما مشاهده کردیم که آنتی بادی ویژه  Anti-rCjaAD خرگوشی هم با پروتئین CjaA و هم با CjaD تولیدی توسط سویه وحشی کمپیلوباکتر ژژونی واکنش می دهد. سپس ژن rCjaAD و CjaA به انتهای C ژن YndF مربوط به لاکتوکوکوس لاکتیس که حاوی موتیف LPTXG است، اضافه شد. ژن های بیان کننده این پروتئین ها تحت کنترل پروموتر Usp45 لاکتوکوکوس لاکتیس رونویسی شد و محصول آنها حاوی توالی پیام Usp45 بود. این استراتژی موجب هدایت بهتر پروتئین ها به سطح سلول می شود که با استفاده از روش ایمونوفلورسانس تایید شد. به منظور بررسی تاثیر موقعیت آنتی ژن بر کارایی نمونه اولیه واکسن، یک سویه لاکتوکوکوس لاکتیس تولید کننده سیتوپلاسمی پروتئین rCjaAD به کار گرفته شد. آزمایشات حیوانی کاهش در بار آلودگی کمپیلوباکتریای را در نمونه سکال نسبت به گروه کنترل نشان داد. همچنین نشان داد که باکتری های لاکتوکوکوس لاکتیس حامل آنتی ژن rCjaAD در سطح سلول، نسبت به سویه های لاکتوکوکوس لاکتیس تولید کننده rCjaAD سیتوپلاسمی، ایمنی بیشتری ایجاد می کند. مزیت مطالعه ما سعی در بکارگیری سویه های لاکتیک اسید باکتری به عنوان ناقل برای واکسیناسیون مرغ ها برای اولین بار می باشد. با وجود اینکه کاهش مشاهده شده در تشکیل کلنی کمپیلوباکتر در مرغ ها نسبتا متوسط است، با این حال نتایج نشان داد که باکتری های اسید لاکتیک می توانند به عنوان وکتوری برای ارائه آنتی ژن های هترولوگ به سیستم ایمنی پرندگان در نظر گرفته شود. علاوه بر این، آنالیز ساختار و ایمنی زایی پروتئین هیبرید rCjaAD  ساخته شده، نشان داد که آنتی ژن CjaA می تواند نقطه شروعی برای ساخت واکسن های چند اپی توپی علیه کمپیلوباکتر باشد.

مقدمه

گونه کمپیلوباکتر عضوی از اپسیلون پروتئوباکترها، ساکنان روده انواع گونه های حیوانی و پرندگان می باشد که عامل اصلی بیماری باکتریایی گاستروانتریت ناشی از غذا در انسان است. این باکتری ها مسئول صدها میلیون مورد عفونت به صورت سالانه در کل جهان هستند. تعداد موارد گزارشی از کمپیلوباکتریوزیس انسانی بین کشورها متنوع بوده و بین 10 تا 100 مورد در هر 100.000 نفر می¬باشد (Kaakoush et al., 2015). در اروپا در سال 2013، 214.779 مورد ثبت شد (EFSA and ECDC, 2015). تعداد گونه های کمپیلوباکتر به طور ثابتی در حال افزایش است. از بین حداقل 34 گونه کمپیبلوباکتر که تاکنون توصیف شده اند،http://www.bacterio.net/campylobacter.html%20consulted%20on%2001/2016)) گونه های کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلای شایع ترین گونه های ایزوبه شده از نمونه های بالینی کمپیلوباکتریوزیس انسانی است(Robyn et al., 2015). در حالی که در کشورهای در حال توسعه، بیماری اندمیک بوده و اساساً کودگان را تحت تاثیر قرار می دهد، در کشورهای صنعتی بیشتر موارد بیماری به صورت تک گیر بوده و با مصرف گوشت مرغ تهیه شده به صورت نامناسب و آلوده به پاتوژن ایجاد می شود. مجرای دستگاه گوارش مرغ های آلوده حاوی میزان بالایی از کمپیلوباکتر ژژونی می باشد(Silva et al., 2011; Hermans et al., 2012; Powell et al., 2012). با توجه به مصرف بالای محصولات گوشت مرغ، مخزن(چینه دانreservoir) مرغ منبع اصلی کمپیلوباکتریوزیس انسان می باشد. برآورد شده است که در صورت کاهش میزان کمپیلوباکتر در روده مرغ تا 2log10 واحد، تعداد موارد کمپیلوباکتریوزیس را 30 برابر کاهش خواهد داد و کاهش تا 3log بایستی خطر سلامت عمومی را حداقل تا 90 درصد کاهش دهد. (EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), 2011; Rosenquist et al., 2013).

Campylobacter jejuni is the most frequent cause of human food-borne gastroenteritis and chicken meat is the main source of infection. Recent studies showed that broiler chicken immunization against Campylobacter should be the most efficient way to lower the number of human infections by this pathogen. Induction of the mucosal immune system after oral antigen administration should provide protective immunity to chickens. In this work we tested the usefulness of Lactococcus lactis, the most extensively studied lactic acid bacterium, as a delivery vector for Campylobacter antigens. First we constructed hybrid protein – CjaA antigen presenting CjaD peptide epitopes on its surface. We showed that specific rabbit anti-rCjaAD serum reacted strongly with both CjaA and CjaD produced by a wild type C. jejuni strain. Next, rCjaAD and CjaA were fused to the C-terminus of the L. lactis YndF containing the LPTXG motif. The genes expressing these proteins were transcribed under control of the L. lactis Usp45 promoter and their products contain the Usp45 signal sequences. This strategy ensures a cell surface location of both analyzed proteins, which was confirmed by immunofluorescence assay. In order to evaluate the impact of antigen location on vaccine prototype efficacy, a L. lactis strain producing cytoplasm-located rCjaAD was also generated. Animal experiments showed a decrease of Campylobacter cecal load in vaccinated birds as compared with the control group and showed that the L. lactis harboring the surface-exposed rCjaAD antigen afforded greater protection than the L. lactis producing cytoplasm-located rCjaAD. To the best of our knowledge, this is the first attempt to employ Lactic Acid Bacteria (LAB) strains as a mucosal delivery vehicle for chicken immunization. Although the observed reduction of chicken colonization by Campylobacter resulting from vaccination was rather moderate, the experiments showed that LAB strains can be considered as an alternative vector to deliver heterologous antigens to the bird immune system. Additionally, the analysis of the structure and immunogenicity of the generated rCjaAD hybrid protein showed that the CjaA antigen can be considered as a starting point to construct multiepitope anti-Campylobacter vaccines.

INTRODUCTION

Campylobacter sp., members of Epsilonproteobacteria, are intestinal inhabitants of a various animal and avian species and, at the same time, are a major cause of human bacterial food-borne gastroenteritis; each year they are responsible for several 100 million cases of infection worldwide. The number of reported confirmed cases of human campylobacteriosis varies between countries and ranges between ten to more than 100 per 100,000 population (Kaakoush et al., 2015). In the EU in 2013, 214,779 cases were recorded (EFSA and ECDC, 2015). The number of Campylobacter genus species is growing constantly. Among at least 34 (http://www.bacterio.net/campylobacter.html %20consulted%20on%2001/2016) species of the Campylobacter genus which have been described so far, the most prevalent species isolated from clinical cases of human campylobacteriosis are C. jejuni and C. coli (Robyn et al., 2015). Whereas in developing countries, the disease is endemic and affects mainly children, in industrialized countries most cases of the disease are mainly sporadic and are caused by the consumption of pathogen-contaminated, improperly prepared broiler meat. The gastrointestinal tract of infected broiler chickens contains a very high load of C. jejuni (Silva et al., 2011; Hermans et al., 2012; Powell et al., 2012). So, taking into consideration the broad consumption of poultry meat products, it has been established that the chicken reservoir is the main source of human campylobacteriosis. It was calculated that decreasing the count of Campylobacter in chicken intestines by 2 log10-units would lower the number of human campylobacteriosis cases 30-fold, and that a reduction by 3 log units should diminish the public health risk by at least 90% (EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), 2011; Rosenquist et al., 2013).

مقدمه

مواد و روش ها

سویه های باکتری، پرایمرها، پلاسمیدها، شرایط محیط و رشد

دست ورزی DNA

دست ورزی کل DNA

ساخت پلاسمیدهای نوترکیب برای تکثیر پروتئین نوترکیب

ساخت وکتور شاتل pUWM1000

ساخت وکتورهای حامل ژن های کمپیلوباکتر با قطعات DNA کد کننده موتیف اتصال به دیواره ژن YndF مربوط به L. lactis

ساخت وکتور کدکننده آنتی ژن های کمپیلوباکتر با موقعیت سیتوپلاسمی

ترانسفورم کردن E. coli و Lactococcus lactis

تولید آنتی بادی های پلی کلونال و پروتئین های نوترکیب

وسترن بلات و SDS-PAGE

تعیین موقعیت سلولی پروتئین های هیبرید- روش ایمونوفلورسانس

بررسی مقاومت مرغ و پاسخ های ایمنی

رشد سویه حامل(Lactococcus lactis IL 1403 حامل ژن های CjaA یا rCjaAD کمپیلوباکتر ژژونی) برای ایمن سازی مرغ

رژیم ایمنی زایی و به چالش کشیدن

بررسی جذب ایمنی وابسته به آنزیم (ELISA)

تهیه آنتی ژن

روش الایزا

آنالیزهای بیوانفورماتیکی

پیش بینی ساختار پروتئین

پیش بینی اپی توپ ها

آنالیزهای آماری

نتایج

پیش بینی ساختار پروتئین

CjaA

CjaD

پیش بینی اپی توپ ها

ساخت سویه های L. lactis بیان کننده ژن های C. jejuni

موقعیت یابی پروتئین های CjaA و rCjaAD

ایمنی زایی مرغ با L. lactis تولید کننده پروتئین هیبرید rCjaAD سطح سلولی

پاسخ آنتی بادی های روده ای و سرم

آنالیز ایجاد مقاومت

بحث

INTRODUCTION

MATERIALS AND METHODS

Bacterial Strains, Primers, Plasmids, Media and Growth Conditions

DNA Manipulations

General DNA Manipulations

Construction of Recombinant Plasmids for Recombinant Protein Overexpression

Construction of the Shuttle Vector pUWM1000

Construction of the Vectors Carrying the Fusion of the Campylobacter Genes to the DNA Fragment Encoding the Cell Wall Anchor Region of L. lactis YndF

Construction of the Vector Encoding Campylobacter Antigens of Cytoplasmic Location

Transformation of E. coli and Lactococcus lactis

Recombinant Protein and Polyclonal Antibody Production

Overexpression and Purification of CjaA, CjaD and rCjaAD

SDS-PAGE and Western Blotting

Cellular Localization of the Hybrid Proteins –Immunofluorescence Assay

Assessment of the Immune Responses and Chicken Protection

Growth of Carrier Strain (Lactococcus lactis IL1403 Containing C. jejuni rcjaAD or cjaA genes) for Chicken Immunization

Immunization and Challenge Regimen

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Antigen Preparation

ELISA Assay

Bioinformatics Analyses

Protein Structure Prediction

Prediction of Epitopes

Statistical Analyses

RESULTS

Protein Structure Prediction

CjaA

CjaD

Prediction of Epitopes

Construction of CjaA Protein Displaying CjaD Peptide Epitopes on its Surface; Analysis of its Antigenicity and Immunogenicity

Construction of the L. lactis Strains Expressing C. jejuni Genes

Localization of CjaA and rCjaAD Proteins

Chicken Immunization with L. lactis Producing Surface Exposed Hybrid Protein rCjaAD

Serum and Intestinal Antibody Responses

Protection Analysis

DISCUSSION