مسدود کردن پرایمرها برای بهبود تکثیر توالی های کمیاب با PCR در نمونه های مختلط
چکیده
پیشینه: بررسی تنوع توالی‌های DNA ابزار قدرتمندی برای تشخیص گونه‌های موجود در یک نمونه‌ی محیطی است. رایج‌ترین استراتژی‌های مولکولی برای تخمین ترکیب تاکسونومیک بر پایه‌ی PCR با پرایمرهای عمومی استوار است که یک توالی همسان از گونه‌های مختلف را تکثیر می‌کند. تنوع توالی‌هایی که در یک نمونه می‌توانند با پرایمرهای عمومی ردیابی شوند، گاهی به دلیل غلظت بالای نمونه‌ها، تحت‌الشعاع قرار می‌گیرد. اگر DNA موجود در نمونه دارای تعداد کپی اندکی از یک توالی در یک غلظت بالا باشد، آنگاه توالی‌های با غلظت کمتر اغلب هنگام PCR تکثیر نمی‌شوند؛ چرا که PCR همیشه به سمت توالی‌های با غلظت بالاتر پیش می‌رود. در بررسی‌های مولکولی رژیم غذایی جانداران، این یک مشکل عمده است چرا که مقدار DNA شکارچی در برابر DNA شکار بسیار بالاتر است.
نتایج: ما یک استراتژی طراحی کردیم که در آن یک PCR عمومی، توالی‌های DNA جانوران خورده‌شده موجود در DNA تخلیص‌شده از نمونه‌های معده‌ی جانوران را تکثیر می‌کند، در حالی که طی این واکنش از تکثیر DNA خود جانور شکارچی با افزودن پرایمرهای مسدود‌کننده‌ی تغییریافته ی ویژه‌ی جانور شکارچی جلوگیری می‌شود. سه نوع پرایمر تغییریافته‌ی مختلف مورد آزمایش قرار گرفت: یک پرایمر ممانعت‌کننده از اتصال که با انتهای 3' پرایمرهای عمومی همپوشانی داشت، یک پرایمر ممانعت‌کننده از اتصال دیگر با یک بهسازی شامل 5 مولکول داُکسی‌اینوزین که آن را به یک اولیگو با قابلیت پرایمری دوگانه تبدیل می‌کرد و یک پرایمر سوم برای توقف طویل‌شدن که جایگاه اتصال آن بین دو پرایمر عمومی است. در همه‌ی پرایمرهای مسدود‌کننده یک توالی جداکننده‌ی C3 قرار داده‌شده‌بود. در مخلوط‌های PCR ساخته‌شده، پرایمرهای ممانعت‌کننده از اتصال بسیار کارآمد‌تر نشان داده و این روش میزان تکثیر امپلیکون های جانور شکارچی را به مقادیر غیر قابل ردیابی رساند؛ حتی در جایی که میزان آن تا 1000برابر DNA شکار بود. DNA شکار نیز قابلیت تکثیر بسیار بالایی در PCR نشان داد در حالی که بدون افزودن پرایمرهای ممانعت‌کننده قابل ردیابی نبود. روش ما برای بررسی رژیم غذایی زمستانی یکی از فراوان‌ترین جانوران دنیا، «کریل قطب جنوب» (Euphausia superba)، به کار گرفته‌شد. DNA جانوران خورده‌شده در معده‌ی کریل با PCR تکثیر شد با وجود این که برای بسیاری از آنها توالی شناخته‌شده‌ای در دسترس ما نبود.
نتیجه‌گیری: ما روشی ساده، مطمئن و ارزان ارائه کردیم که برای موقعیت‌های بسیاری که یک توالی کمیاب باید در حضور غلظت‌های بالاتر توالی‌های دیگر با جایگاه‌های یکسان اتصال پرایمر PCR شود می‌تواند به خوبی به کار گرفته‌شود.
پیشینه
Euphausia superba گونه‌ی غالب کریل در قطب جنوب است و یکی از اجزای کلیدی اکوسیستم اقیانوس است [برای مثال [1]]. برای مثال، جمعیت کریل قطب جنوب در دریای اسکاشیا 208میلیون تن تخمین زده می‌شود [2] و شکار کریل پتانسیل تبدیل شدن به بزرگترین ماهیگیری دنیا را دارد [3]. مدتها است که مشخص شده‌است که Euphausia superb اصولاً به عنوان یک گیاهخوار در دوره‌های غنی از پلنگتون بهار و تابستان، حداقل در طول روز، تغذیه می‌کند [برای مثال [4]، گرچه مصرف غذاهای هتروتروفیک هم گزارش شده‌است [5]]. اما هنوز اطمینانی از این که کریل بزرگسال قطب جنوب چگونه در طول زمستان زنده می‌ماند وجود ندارد. با در نظر داشتن این که کریل ذخیره‌ی چربی چندانی تولید نمی‌کند، استراتژی‌های مختلفی پیشنهاد شده‌اند. از جمله‌ی این استراتژی‌ها عبارتند از آب‌رفتگی [برای مثال [6و7]]، میزان متابولیسم کمتر [8و9]، تغییر به سمت همه‌چیز‌خواری [10] و یا تغذیه از زیوِگان زیر یخ‌ها [برای مثال [11]].
Abstract
Background: Identification of DNA sequence diversity is a powerful means for assessing the species present in environmental samples. The most common molecular strategies for estimating taxonomic composition depend upon PCR with universal primers that amplify an orthologous DNA region from a range of species. The diversity of sequences within a sample that can be detected by universal primers is often compromised by high concentrations of some DNA templates. If the DNA within the sample contains a small number of sequences in relatively high concentrations, then less concentrated sequences are often not amplified because the PCR favours the dominant DNA types. This is a particular problem in molecular diet studies, where predator DNA is often present in great excess of food-derived DNA.
Results: We have developed a strategy where a universal PCR simultaneously amplifies DNA from food items present in DNA purified from stomach samples, while the predator's own DNA is blocked from amplification by the addition of a modified predator-specific blocking primer. Three different types of modified primers were tested out; one annealing inhibiting primer overlapping with the 3' end of one of the universal primers, another annealing inhibiting primer also having an internal modification of five dI molecules making it a dual priming oligo, and a third elongation arrest primer located between the two universal primers. All blocking primers were modified with a C3 spacer. In artificial PCR mixtures, annealing inhibiting primers proved to be the most efficient ones and this method reduced predator amplicons to undetectable levels even when predator template was present in 1000 fold excess of the prey template. The prey template then showed strong PCR amplification where none was detectable without the addition of blocking primer. Our method was applied to identifying the winter food of one of the most abundant animals in the world, the Antarctic krill, Euphausia superba. Dietary item DNA was PCR amplified from a range of species in krill stomachs for which we had no prior sequence knowledge.
Conclusion: We present a simple, robust and cheap method that is easily adaptable to many situations where a rare DNA template is to be PCR amplified in the presence of a higher concentration template with identical PCR primer binding sites.
Background
Euphausia superba is the dominant krill species in the Antarctic and a key component of the Southern Ocean ecosystem [e.g. [1]]. The population of Antarctic krill in the Scotia Sea alone is estimated to be 208 million tonnes [2] and the krill fishery has the potential to become the world's largest fishery [3]. It has long been recognized that Euphausia superba feeds primarily as a herbivore during the phytoplankton-rich periods of spring and summer, at least during daytime [e.g. [4], although heterotrophic food items are also known to be consumed [5]]. However, there is uncertainty about how adult Antarctic krill survive the winter. A variety of strategies have been proposed since krill do not seem to build up large fat reserves. These strategies include shrinkage [e.g. [6,7]], lowered metabolic rates [8,9], switching to omnivory [10] or feeding on ice associated biota [e.g. [11]].
چکیده
پیشینه
روش‌ها
طراحی پرایمر
نمونه‌برداری و استخراج DNA
آزمون پرایمرهای ممانعت‌کننده
تکثیر DNA شکار از معده‌ی کریل با PCR
شناسایی کلون‌ها
نتایج
عملکرد پرایمرهای ممانعت‌کننده
بررسی معده‌ی کریل
بحث
نتیجه‌گیری
Abstract
Background
Methods
Primer design
Sampling and DNA extraction
Testing of blocking primers
PCR amplification of prey DNA from krill stomachs
Clone identification
Results
Blocking primer performance
Krill stomach analysis
Discussion
Conclusion
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت ورد (word) با قابلیت ویرایش، بدون آرم سایت ای ترجمه
- ترجمه فارسی مقاله با فرمت pdf، بدون آرم سایت ای ترجمه