دانلود رایگان مقاله ردیابی چندگانه‌ بهینه جهش 7 KRAS با روش PCR کمی مخصوص برای آلل

چکیده

          تعیین وضعیت جهش‌یافته بودن یا نبودن KRAS در نمونه‌های توموری اهمیت بنیادینی در مدیریت بیماران مبتلا به سرطان ریه یا سرطان روده‌ی بزرگ دارد؛ چرا که این جهش‌ها مانع درمان با آنتی‌بادی‌های مونوکلونال گیرنده‌های فاکتورهای رشد اپیدرمی (EGFR) می‌شوند. در این پژوهش، روش PCR کمّی مخصوص برای الل چندگانه، سریع و ارزان‌قیمتی را گزارش می‌دهیم که می‌تواند هفت جهش اصلی و مرتبط با مسائل بالینی در KRAS را شناسایی و همزمان، ژن‌های KRAS جهش‌نیافته را در سلول‌های توموری و بافت‌های بیماران سرطان روده‌ی بزرگ تکثیر کند. نمونه‌های مثبت در تست‌های چندگانه تحت تحلیل‌های مخصوص برای الل قرار گرفتند تا جهش هر کدام به طور خاص بررسی شود. DNA مرجع سرطان‌های انسانی اعم از G12A، G12C، G12D، G12R، G12S، G12V و G13D اختصاصی بودن تست را با =<۱٪ حساسیت الل‌های جهش‌یافته تأیید کردند. همچنین، کاربردی بودن تحلیل چندگانه‌ی جهش‌های KRAS با انجام آزمایش‌های جاسازی پارافین فیکس‌شده توسط فرمالین (FFPE) بر روی بیوپسی‌های سرطان روده‌ی بزرگ نشان داده شد. در نتیجه، تکثیر همزمان DNA جهش‌نیافته منجر به حذف داده‌های منفی کاذب از نمونه‌های تخریب‌شده می‌شود. همچنین، نتایج این روش مقرون‌به‌صرفه با نتایج حاصل از توالی‌یابی DNA در بافت‌های FFPE هم‌خوانی دارد، اما در حالتی که غلظت‌های DNA محدود هستند، حساسیت بالاتری دارد.

مقدمه

            سرطان روده‌ی بزرگ سومین سرطان شایع در مردان و دومین سرطان شایع در زنانِ سراسر جهان است [۱]. کتاکسیمب  و پانیتومامب  آنتی‌بادی‌های مونوکلونالی هستند که در روش‌های بالینی برای درمان کارسینومای روده‌ی بزرگ، علیه گیرنده‌ی EGFR به کار می‌روند [۲]. جهش‌های سرطان‌زای KRAS مدت‌هاست که به عنوان مانع روش‌ درمانی مذکور شناخته شده‌اند، چرا که منجر به تولید پروتئینی می‌شوند که همواره فعال است و به شکل مستقل از محرک، عملگردهای پایین‌دست EGFR، مانند آبشارهای RAF، MEK و ERK را فعال می‌کند [۳، ۴، ۵]. فعال‌سازی به وسیله‌ی فسفریلاسیون پروتئینی در چند تشکیل‌دهنده‌ی مسیرهای MAPK در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، ماندگارتر از دیگر گروه‌های توموری است. این فعال‌سازی‌های سرطان‌زا در نمونه‌های جهش‌یافته برای KRAS، در ۳۵ تا ۴۰ درصد از کارسینوماهای روده‌ی بزرگ دیده می‌شود و در بیشتر موارد، جهش در کدون ۱۲ (۸۰٪) و ۱۳ (۱۵٪) از اگزون ۲ رخ داده است [۶، ۷، ۸]. جهش‌ در موقعیت‌های دیگر، برای مثال کدون ۶۱، ۱۱۷، ۱۴۶ و ۱۵۴ نیز دیده شده اما فراوانی بسیار کم‌تری (تنها حدود ۱٪) به خود اختصاص می‌دهد [۹، ۴]. آژانس پزشکی اروپا (EMA)، شبکه‌ی جامع ملی سرطان (NCCN)، انجمن سرطان‌شناسی بالینی آمریکا (ASCO) و اداره‌ی مواد غذایی و دارویی ایالات متحده‌ی آمریکا (FDA) توصیه می‌کنند که هدف قرار دادن EGFR به وسیله‌ی کتاکسیمب و پانیتومامب نیازمند این است که بیمار نسخه‌ی سالم و جهش‌نیافته‌ی KRAS را دارا باشد. بنابراین، غربال‌گری ساده و دقیق جهش‌های KRAS پیش از تیمار کردن با آنتی‌بادی علیه EGFR ضروری است [۲، ۱۰]. در موارد کمبود فراوانی  DNA جهش‌یافته در مقایسه با طبیعی، تشخیص زودهنگام در بافت‌های دردسترس و موجود در کلینیک‌ها مشکل است. این امر نیاز به انجام تکنیک‌های مشکل، زمان‌بر و گران‌قیمتی برای ایزوله کردن سلول‌های توموری پیش از آنالیز مولکولی ایجاد می‌کند که برای آزمایش‌های پاتولوژیک رایج نامناسب است [۱۱]. از این رو، تشخیص و شناسایی الل‌های در اقلیت چالشی‌ست که به صحت و حساسیت تکنیک‌های مولکولی بستگی دارد و قادر است توانایی تشخیص جهش‌های کم‌یاب را پایین بیاورد.

           تکنیک‌های مولکولی زیادی برای تشخیص جهش‌های KRAS ایجاد شده‌اند که هر کدام مزایا و مضرات متفاوت، هزینه‌های گوناگون و تفاوت‌های قابل توجهی در زمینه‌ی مدت آزمایش، اختصاصی بودن، حساسیت، توانایی تشخیص جهش‌های جدید، توانایی کوانتیده کردن الل‌های جهش‌یافته و تکرارپذیری نتایج دارند [۱۲، ۱۳، ۱۴]. در بین این روش‌ها، توالی‌یابی به روش سنگر کماکان استاندارد طلایی به شمار می‌رود؛ با این حال این روش حساسیت پایینی دارد و نیازمند بین ۱۰ تا ۳۰ درصد الل‌های KRAS جهش‌یافته از بین نمونه‌های طبیعی است [۱۲، ۱۵]. با توجه به این که PCR همه‌ی الل‌ها را با بازده برابر نسبت به غلظت‌های اولیه تکثیر می‌کند [۱۶]، روشی مطلوب برای کاش تکثیر الل‌های طبیعی است [۲، ۱۷]. PCR اختصاصی برای الل، که به عنوان سیستم تکثیری مقاوم در برابر جهش یا ARMS نیز شناخته می‌شود، بر این اصل استوار است که تکثیر در حالتی که باز آلی انتهای ۳’ در پرایمر با توالی الگو اتصال برقرار می‌کند، بازده بالایی دارد؛ در حالی که چنانچه این اتصال برقرار نشود و یا اتصال اشتباه برقرار شود، بازده پایین‌تر است [۱۸، ۱۹]. اختلاط روش‌های PCR اختصاصی برای الل و PCR زمان واقعی  بر اساس کاوشگر‌های Taq-Man ابزار مناسبی برای ردیابی جهش‌ها با حساسیت و مقدار بالا به دست می‌دهد. تست‌هایی بر این اساس جهت استفاده در محیط بالینی ایجاد شده‌اند (۲۰-۲۵) و چند کیت آزمایشگاهی برای کاربردهای بالینی در بازار موجود هستند؛ برای مثال، کیت KRAS RGQ PCR ار تِراسکرین  (کیاژن ) و کیت Cobas KRAS (TaqMelt PCR). [۲۱، ۲۲، ۲۵، ۲۶، ۲۷، ۲۸، ۲۹، ۳۰]

         در این مطالعه، ما روشی سریع، مقرون‌به‌صرفه و چندگانه جهت غربالگری الل‌های برای جهش‌های رایج KRAS در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ موجود در بیوپسی‌های FFPE در بیماران با حساسیت بالا معرفی می‌کنیم. تست ما بر اساس PCR کمّی چندگانه در یک لوله، با استفاده از هفت پرایمر مخصوصی برای الل می‌باشد که تنها به یک الگوی DNA جهش‌یافته متصل می‌شوند. نمونه‌هایی که با نتیجه‌ی مثبت از این ازمایش بیرون آمدند تحت آزمایش‌های بیشتری قرار گرفتند تا وجود جهش در الل خاص موردنظر در آن‌ها تأیید شود.

مواد و روش‌ ها

DNA مرجع و نمونه‌های بالینی

         ما از DNAژنومی مرجع استاندارد و دارای ژن طبیعی KRAS و همچنین DNA دارای هفت جهش نقطه‌ای در کدون ۱۲ و ۱۳ KRAS (G12D، G12A، G12R، G12C، G12S، G12V و G13D) استفاده کردیم. مرجع استانداردهای DNA ژن KRAS، هورایزن ، واقع در کمبریج، CB26 9PL، بریتانیا بود.

          FFPEهای مربوط به آدنوکارسینومای روده‌ی بزرگ از ۳۲ بیمار مبتلا به سرطان روده‌ی بزرگ گرفته و از طریق مرکز توالی‌یابی و آنالیز سنگر (CESAN) در انستیتوی پژوهش‌ها‌ی علمی ونزوئلا (IVIC) جمع‌آوری شد. این پژوهش توسط کمیته‌ی اخلاقی انستیتو تأیید شد و داده‌های مربوط به بافت‌های جمع‌آوری‌شده به شکل ناشناس تحلیل شدند.

استخراج DNA ژنومی از نمونه‌های FFPE

           DNA از سلول‌های کشت‌داده‌شده به وسیله‌ی کیت کلروفرم-DNAzol و طبق توصیه‌ی شرکت تولیدکننده (اینویتروژن ) استخراج شد. DNA ژنومی از بافت‌های FFPE با استفاده از کیت QIAamp مخصوصی FFPE DNA تولید شرکت کیاژن طبق توصیه‌ی شرکت تولید‌کننده استخراج شد. به طور خلاصه، تومورها از بلوک‌های پارافینی جدا، به قطعات ۱۰ میکرومتری تقسیم و در لوله‌های ۱.۵ میلی‌لیتری ذخیره شدند. پارافین به وسیله‌ی زایلن ز بلوک‌ها جدا شد و نمونه‌ها در دمای محیطی خشک شدند. مقادیر دقیق DNA به روش مقدارسنجی فلوئورومتریک توسط دستگاه فلوئوریمتری کوبیت  ورژن ۲.۰ (Q32866، اینویتروژن) سنجیده شد. نمونه‌های DNA در ۲۰- درجه ذخیره شدند.

ردیابی جهش به وسیله‌ی تست PCR کمّی

          جهش‌های موجود در کدون‌های ۱۲ و ۱۳ ژن KRAS (به شماره‌ی NG_007524) به وسیله‌ی PCR کمّی با استفاده از پرایمرهای مخصوص برای الل (AsP) که برای هر یک از هفت جهش و همچنین ناحیه‌ی جهش‌نیافته طراحی شده بودند، مشخص شدند [۲۲] (به جدول ۱ موجود در بخش تکمیلی مقاله مراجعه شود). باز آلی انتهای ۳’ برای هر پرایمر با توجه به جهشی که می‌بایست شناسایی می‌کرد طراحی شد. همچنین، یک ناجوری  مصنوعی در باز یکی‌مانده‌به‌آخر و یا باز پیش از آن القا شد تا اختصاصی بودن اتصال را افزایش دهد [۲۲]. واکنش‌های PCR در پلیت‌های ۴۸-چاهکی در سیستم PCR زمان واقعیِ اکو  متعلق به شرکت ایلومینا  انجام شدند.شرایط واکنش برای هر چاهک برابر بود با: ۰.۳۵ میکرومولاز پرایمر Forward، ۰.۳۵ میکرومولار پرایمر Reverse، ۰.۵ میکرومولار کاوشگر و ۳ میکرومولار DNA الگو با غلظت‌های مختلف. واکنش‌ها با استفاده از مخلوط آماده‌ی ژنوتایپینگ 1XTaqMan (به شماره‌ی کاتالوگ ۴۳۷۱۳۵۵، شرکت اپلاید بیوسیستمز ، فاستر سیتی ، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) در حجم نهایی برابر با ۱۰ میکرولیتر انجام شد. بر خلاف یک پروتکل قدیمی Taqman که از دمای اولیه‌ی ۹۵ درجه برای واسرشتی DNA به مدت ۱۰ دقیقه، ۵۰ چرخه در ۹۰ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ ثانیه و ۶۰ درجه‌ی سانتیگراد برای ۶۰ ثانیه استفاده کرده بود، واکنش PCR کمّی ما از یک مرحله‌ی ده‌دقیقه‌ای در ۹۰ درجه‌‌ی سانتیگراد پیش از شروع واکنش‌های اصلی استفاده می‌کرد، ۵۰ چرخه در ۹۵ درجه‌ی سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه و ۶۰ درجه‌ی سانتیگراد برای ۳۰ ثانیه داشت. همه‌ی نمونه‌ها در قالب سه‌تایی تکرار می‌شدند. در هر چرخه، حداقل یک کنترل منفی ( بدون DNA) مورد استفاده قرار گرفت.

تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل (Mult-AsP)

        تست‌های چندگانه‌‌ی مخصوص برای الل بر اساس همین پروتکل اما با استفاده از همه‌ی هفت پرایمر مخصوص برای الل جهت شناسایی جهش KRAS، همان پرایمر Reverse و کاوشگر Taqman در یک لوله‌ی آزمایش انجام شدند. این واکنش‌های چندگانه حاوی ۰.۴ میکرومولار از هر پرایمر Forward، ۰.۵۵ میکرومولار از هر پرایمر Reverse، ۰.۵ میکرومولار کاوشگر و ۳۵ نانوگرم بر میکرولیتر DNA الگو با شرایط PCR که در بالا ذکر شد بودند. برای هر الگو، مقدار Cq در PCR مرجع ثبت و برای هر واکنش چندگانه، ΔCqمحاسبه شد (تفاوت‌ها در چرخه‌ها بین دو روش تست مخصوص برای الل و تست PCR مرجع، و همچنین تفاوت‌ها در چرخه‌ها بین دو روش تست چندگانه‌ی مخصوص برای الل و تست PCR مرجع).

ژنوتایپینگ KRAS در نمونه‌های بالینی

        ژنوتایپینگ KRAS در بافت‌های FFPE شامل امپلیکون های غیرجهش‌یافته‌ی مرجع (NM) و پرایمرهای چندگانه‌ی مخصوص برای الل در تست PCR کمّی می‌شد. پروتکل سنجش نمونه‌های بالینی شامل یک تکثیر در مرحله‌ی اول برای امپلیکون‌های جهش‌نیافته‌ی مرجع و تست‌ چندگانه‌ی مخصوص برای الل می‌شد. هنگامی که نتیجه‌ی PCR کمّی برای DNA جهش‌نیافته‌ی مرجع منفی می‌شد، نمونه دیگر مورد آنالیزهای بعدی قرار نمی‌گرفت. با این حال، اگر تکثیر چندگانه منفی و امپلیکون جهش‌نیافته مثبت می‌شد، نمونه منفی در نظر گرفته می‌شد. در مواردی که نمونه‌های بالینی برای تست چندگانه نتیجه‌ی مثبت به دست می‌دادند، بر روی آن‌ها هفت واکنش جداگانه PCR با پرایمرهای مربوط به KRAS جهش‌یافته انجام می‌شد تا جهش‌ها شناسایی شوند. همه‌ی نمونه‌ها در قالب‌های سه‌تایی آزمایش شدند.

Abstract

         Establishing the KRAS mutational status of tumor samples is essential to manage patients with colorectal or lung cancer, since these mutations preclude treatment with monoclonal anti-epidermalgrowth factor receptor (EGFR) antibodies. We report an inexpensive, rapid multiplex allele-specific qPCR method detecting the 7 most clinically relevant KRAS somatic mutations with concomitant amplification of non-mutated KRAS in tumor cells and tissues from CRC patients. Positive samples evidenced in the multiplex assay were further subjected to individual allele-specific analysis, to define the specific mutation. Reference human cancer DNA harbouring either G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V and G13D confirmed assay specificity with 1% sensitivity of mutant alleles. KRAS multiplex mutation analysis usefulness was also demonstrated with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) from CRC biopsies. Conclusion. Co-amplification of non-mutated DNA avoided false negatives from degraded samples. Moreover, this cost effective assay is compatible with mutation detection by DNA sequencing in FFPE tissues, but with a greater sensitivity when mutant DNA concentrations are limiting.

Introduction

           Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer diagnosed in men and the second most common in women worldwide [1]. Cetuximab and Panitumumab are monoclonal antibodies directed against the epidermal growth factor receptor (EGFR) clinically used for the moleculartargeted therapy on colorectal carcinoma [2]. Oncogenic KRAS mutations are well established negative predictors of response to anti-EGFR therapies, because they generate a constitutively active protein, leading to stimulus independent, persistent activation of downstream effectors,such as the RAF/mitogen-activated protein kinase kinase (MEK)/extracellular signal-regulated kinase (ERK) cascade, [3,4,5]. Phosphoprotein activation of several MAPK signaling components frequently is stronger in KRAS-mutants than in any other tumor groups. The mutant KRAS associated oncogenic activation is observed in 35% to 40% of colorectal carcinomas, and most cases have mutations in codons 12 (80%) and 13 (15%) of exon 2 [6,7,8]. Mutations in other positions,such as codons 61, 117, 146 and 154, are much less frequent, representing only ~1% of all KRAS gene mutations [9,4]. The European Medicines Agency (EMA), the National Comprehensive Cancer Network (NCCN), the American Society of Clinical Oncology (ASCO) and the US Food and Drug Administration (FDA) recommend that treatment of cetuximab and panitumumab to target EGFR,requires that CRC patients posses a wild type KRAS. Hence, simple and sensitive screening for KRAS mutations prior to treatment with an anti-EGFR antibody therapy is indispensable [2,10]. Early detection in clinically available tissue is difficult in cases with low abundance mutations relative to wild type DNA. This requires laborious, expensive, time consuming techniques of microdissectionto isolate the tumor cells prior performing molecular analysis, unsuitable for routine pathological analysis [11]. As such, the detection and identification of minority alleles present at low abundance is a challenge and dependent upon the accuracy and sensitivity of the moleculartechniques and by the methods employed, limiting the diagnostic potential of such rare mutations.

          Many moleculartechniques have been developed for detectingKRAS mutations, each with its advantages and disadvantages, differ regarding cost, test duration, sensitivity, specifity, reproducibility according to the issue tested (frozen or formalin fixed, paraffin embedded tissue), capacity to quantify the mutated alleles, and ability to detect new mutations [12,13,14].

         Among these methods, Sanger sequencing, is considered a gold standard, but has low sensitivity, requiring approximately 10–30% mutated KRAS alleles in a wild type background [15,12]. Since PCR will amplify all alleles with approximately equal efficiency comparable to theirinitial concentrations [16], it is desirable to selectively decrease the wild type amplification [2,17]. Allele-specificPCR, also known as amplification refractory mutation system (ARMS), is based on the principle that amplification is efficientwhen the 30 terminal base of the primer matches the template, whereas amplification is inefficient or even nonexistent when there is a mismatch [18,19]. Combining allele-specificPCR and real-time PCR techniques based on TaqMan probes allows high-throughput and sensitive detection of mutations with an improved interpretation of PCR results. Assays based on this strategy have been developed for clinical applications [20–25] and several commercial kits have been developed for clinical applications, such as Therascreen KRAS RGQ PCR kit (Qiagen) and Cobas KRAS kit (TaqMelt PCR) [21,22,25–30].

         In this study, we developed a rapid, cost effective, multiplex allele specific assay high throughput for screening of the most common KRAS mutations in codons 12 and 13 in FFPE biopsies from cancer patients with high sensitivity. Our assay is based in a single tube multiplex qPCR using 7 allele specific primers that anneal specifically to a mutated DNA template. Positive samples evidenced in the multiplex assay were furthersubjected to individual allele-specific analysis, to confirm the specific mutation.

Materials and Methods

Reference DNA and clinical samples

          We used genomic DNA of reference standard harboring KRAS wild-type DNA and seven point mutations in KRAS codons 12 and 13 (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, and G13D). The KRAS DNAs reference standards were from Horizon, Cambridge CB25 9PL, UK.

       Formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE) colorectal adenocarcinomasfrom 32 patients with colorectal carcinoma were collected from the Centre for Sanger Sequencing and Analysis (CESAN) of the Venezuelan Institute for Scientific Research (IVIC), Venezuela. The study was approved by the Ethics Committee of the Institute and the data of tissue samples were analyzed anonymously.

Genomic DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded samples

         DNA was isolated from cultured cells by DNAzol–chloroform deproteinization as recommended by the manufacturer (Invitrogen). The Genomic DNA (gDNA) from the FFPE sections was isolated using a QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN) according to the manufacturer’s instructions. Briefly, tumors were manually micro-dissected from paraffin-embedded blocks, and 10 μm thick sections were collected in a 1.5 ml tube. Paraffin was removed from the tissue blocks with xylene, and samples were air-dried. DNA quantity was determined by fluorometric quantitation in a Qubit 2.0 fluorimeter(Q32866, Invitrogen). DNA samples were stored at -20°C until needed.

Mutation Detection by qPCR assay

          Mutations in codons 12 and 13 of the KRAS gene (accession N° NG_007524) were determined by qPCR using allele specific primers (AsP) designed for each of seven mutations and a non-mutated (NM) region used as a reference amplicon [22] (S1 Table). The 3´ terminal base of each allele specific primer was adapted according to its corresponding mutation. In addition, an artificial mismatch at the penultimate or antepenultimate base was included in the allele specific primers to improve specificity [22] PCR reactions mixtures were carried out in 48-well plates in Eco Illumina Real Time PCR system (Illumina). Our uniplex reaction conditions included 0.35 μM forward primer, 0.35 μM reverse primer and 0.5 μM probe and 3 μl of DNA template of varying concentration. Reactionswere performed in 1X TaqMan Genotyping Mix (Cat N° 4371355, Applied Biosystems, Foster City,Ca USA) in a 10 μl total volume. In contrast to a previous Taqman uniplex protocol using initial DNA denaturation 95°C for 10 minutes, 50 cycles of 90°C for 15 sec and 60°C for 60 sec [22], our multiplex qPCR similarly used a prior 95°C for 10 min step, but required optimization such as 50 cycles of 95°C for 30 sec and 60°C for 30 sec. Each sample was evaluated in triplicate. At least one negative control with no DNA (NTC) was included in every run.

Multiplex Allele-SpecificAssay (Mult-AsP)

         Multiplex allele specific assays were performed according to the same protocol but using all seven allele specific primers for the identification of KRAS mutation, the same reverse primer and the Taqman probe in a single tube. These multiplex reactionsincluded 0.4 μM of each allele specific forward primer, 0.55 μM reverse primer and 0.5 μM probe and 35 ng/μl DNA template with PCR conditions described above. For each template, the Cq values were recorded for reference PCR, each allele specific PCR and multiplex allele specific, and the corresponding ΔCq values were calculated (differencesin threshold cycles between the allele-specific assay and the reference assay, and differencesin threshold cycles between the multiplex allele specific and the reference assay).

KRAS genotyping in clinical samples

         The KRAS genotyping in clinical FFPE tissues also included the non-mutated reference amplicon (NM) and multiplex allele specific primers in the qPCR assay. The protocol for evaluation of clinical samples involved a first step the amplification simultaneous of both non-mutated reference amplicon and multiplex allele specific assay. When the qPCR for the non-mutated reference DNA was negative, the sample was not analyzed further. However, if the multiplex amplification was negative and the non-mutated amplicon positive, the sample is considered negative. In case of multiplex-positive clinical samples, these were subjected to seven individual PCR reactions KRAS mutants with allele specific primer for the identification of mutation. All samples were evaluated by triplicate.